簡介：目的艱難梭菌CLOSTRIDIUMDIFFICIIE是造成抗生素相關性結腸炎及偽膜性結腸炎PMC的最常見致病菌。該菌造成老年人和免疫功能低下的病人抗生素相關性腹瀉及腸炎的發(fā)病率及死亡率明顯升高。CDIFFICILE產毒株準確快速的診斷、鑒定，對確定病源、控制其傳播、有效治療患者是極其重要的。國外建立的酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA檢測CDIFFICILE毒素，其優(yōu)點是靈敏度和特異度高，結果可在24小時內得出，從而更適合指導臨床實際工作，故被大力推廣，但國內對艱難梭菌診斷試劑研究較少，尤其是對CDIFFICILE細胞毒素BCDTB的檢測。本課題利用CDTB特點，以基因工程技術對其羧基末端功能區(qū)進行克隆、表達并純化出該蛋白，制備多克隆抗體，主要目的在于對該重組蛋白生物學特性進行研究和探索，以期建立一種可快速、穩(wěn)定的檢測出CDIFFICILE細胞毒素B的ELISA診斷試劑。方法1、基因工程技術制備CDTB膜受體結合區(qū)域的重組蛋白。以CDIFFICILE標準株VPI10463的全長DNA序列為模板，利用PCR技術擴增出編碼CDTB膜受體結合區(qū)域的功能基因，經ECI和XHOI雙酶切后，定向插入同樣經這兩種酶雙酶切的原核表達載體PET22B中，在DNAT4連接酶作用下進行連接以獲得重組質粒。重組質粒經測序，結果與GENBANK記錄的CDIFFICILEVPI10463的CDTB羧基末端BP56497496基因序列相比對。將正確的重組子轉化至ECOLIBL21DE3細菌中，經IPTG誘導表達出特異性蛋白，利用SDSPAGE檢測重組蛋白。2、親和色譜法純化重組蛋白并進行WESTERNBLOT分析。因表達載體PET22B具有HISTAG序列，故與固定化金屬離子NI2之間具有親合力，金屬螯合到固相支持物共價結合的反應性基團亞氨二乙酸IDA上，用咪唑將重組蛋白洗脫下來，從而達到純化的目的。本研究選用NOVAGEN公司的HISTAG親合純化產品HISBIND樹脂和緩沖液試劑盒。純化后采用COOMASSIEBRILLIANTBLUEG250比色法，以牛血清白蛋白BSA，SIGMA為標準建立標準曲線，測定重組蛋白濃度；并利用HISTAG單克隆抗體與重組蛋白進行WESTERNBLOT分析。3、多克隆抗體制備及其生物學特性的研究。以純化重組蛋白為抗原，免疫純種雄性新西蘭大白兔，在第4次加強免疫后第10天，制備多抗血清，利用雙向免疫擴散法和間接酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA法檢測抗體效價，同時檢測重組蛋白和從NOVAGEN公司購得的CDIFFICILE細胞毒素B這兩種材料的抗原相關性。以重組蛋白與制備的多抗血清進行WESTERNBLOT分析以檢測抗體的特異性。用自制的多克隆抗體通過間接ELISA法對5株艱難梭菌產毒株、2株大腸桿菌、1株雙歧桿菌進行艱難梭菌B毒素檢測。結果1、利用PCR技術擴增出編碼CDTB膜受體結合區(qū)域的功能基因為1848BP，經測序與相應CDIFFICILE標準株VPI10463序列區(qū)域的基因完全相同。目的基因與原核表達載體PET22B連接后獲得的重組質粒，測序結果與GENBANK記錄的CDIFFICILEVPI10463的CDTB羧基末端BP56497496基因序列相比對符合率達99％。將經鑒定的CDTBR陽性克隆子在IPTG的誘導下表達，然后進行10％SDSPAGE電泳分析，結果發(fā)現(xiàn)，經誘導后表達的重組蛋白相對分子質量為71300，與預期的蛋白大小一致。2、根據(jù)金屬螯合親和色譜法在非變性條件下純化重組蛋白，純化后的可溶性重組蛋白相對分子質量為71300，有少許降解，純度達到90％。重組蛋白純化后根據(jù)COOMASSIEBRILLIANTBLUEG250CHROMATOMETRY比色法測出的蛋白濃度為0762MGML。免疫印跡試驗說明重組蛋白與HISTAG單克隆抗體可以發(fā)生特異性結合3、獲得了相應的多克隆抗血清，重組蛋白的抗原性是CDIFFICILE細胞毒素B抗原性的一部分。WESTERNBLOT分析抗艱難梭菌B毒素膜受體結合蛋白多克隆抗體可以和重組蛋白CDTBR結合，與ECOLI菌體裂解蛋白有非特異性的反應。間接酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA法測定抗體效價均為110000以上。自制多克隆抗體對8株臨床細菌進行艱難梭菌B毒素檢測顯示，3株艱難梭菌產毒株、1株大腸桿菌為陽性結果，其余為陰性結果。結論L、本研究參考CDIFFICILE國際標準株VPI10463基因序列，用自行設計的CDB3引物在PCR反應中表現(xiàn)出較高的特異性，為理想的引物序列。蛋白電泳分析表明獲得了高效表達的CDIFFICILETOXINB3克隆株。2、本研究利用基因工程得到的重組蛋白，WESTERNBLOT證實表達的蛋白與本研究所設計相一致。為進一步研究CDAD的診斷試劑和免疫保護作用奠定了重要的實驗基礎。3、通過動物實驗本研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白具有良好的免疫原性，該多克隆抗體具有良好的生物學活性、較好的特異性。但因為是多克隆抗體，故特異性不高，需要更深入地研究此重組蛋白，最終制備單克隆抗體，為CDIFFICILE感染的臨床診斷提供特異性的診斷試劑。

簡介：山東省醫(yī)學科學院碩士學位論文人白細胞介素21的基因克隆、表達及對NK92細胞生物學作用的初步研究姓名鄭瑞申請學位級別碩士專業(yè)免疫學指導教師王郡甫20080518山東省醫(yī)學科學院碩士學位論文球蛋白IG的廣泛調解因子共同調節(jié)IGG和IGE的類別轉換及IG的合成【121314】。IL。21和IL15協(xié)同誘導NAIVECD4410W和MEMORYCD44HICD8T細胞的增殖，增加產生IFN吖的CD8T數(shù)量，誘導顆粒酶B基因的表達，這表明IL21不僅能協(xié)同促進T細胞的克隆增殖還能增強T細胞的功能效應【1516】。IL一21單獨不能使NK細胞增殖或存活，甚至會增JJHNK細胞凋亡率【17】。低劑量的IL21能夠協(xié)同IL一2或IL一15促進NK細胞的增殖，高劑量的IL2L卻抑制NK細胞的增殖，但這種抑制同時伴隨著向大顆粒淋巴細胞表型的轉化，產生高水平的穿孔素和IFN吖，增強NK細胞細胞毒活性【18191?？紤]至LJIL21對NK細胞功能的影響時，往往離不開NK細胞表面受體方面的研究。NKG2D是NK細胞重要的活化性受體，曾有研究表明IL21可以通過NKG2D機制增強腫瘤模型鼠的抗腫瘤效應【20】。但是也有文獻報道IL21通過負調節(jié)接頭分子DAPL0的基因表達而下調人PRIMARYNK和CD8T細胞表面NKG2D／DAPL0的表達，從而抑制PRIMARYNK細胞通過NKG2D介導的細胞毒作用【211。這可能是由種屬差異造成的。本實驗擬通過構建含IL21基因的原核表達載體，優(yōu)化RHLL21的表達條件；探索RHIL21包涵體蛋白質最佳復性條件；用NINTA親和層析柱純化出高純度的RHIL21，為大量生產RHLL21及其生物學研究或臨床應用奠定基礎。在此基礎上以NK92細胞為效應細胞，通過對NK92細胞的增殖和殺傷功能的影響以及對表面活化性受體NKG2D的表達的分析，來初步探討IL21對NK細胞的生物學作用。方法和結果1人IL21基因的克隆和分析根據(jù)GENEBANK報告的人類IL一21基因序列，我們設計一對編碼人IL2L成熟肽的引物。上游包含NDEI酶切位點，下游含XHOI酶切位點。以本實驗室保存的重組質粒PCDNA3IL21為模板，用所設計的引物擴增出IL2L目的基因。PCR片段用低熔點瓊脂糖凝膠分離純化并與TA載體PMDL8T連接，轉化到DH5A感受態(tài)細胞，平鋪于含100TG／ML氨芐西林的LB培養(yǎng)板上篩選陽性克隆。再通過PCR、雙酶切及測序方法對陽性克隆進行鑒定，結果表明成功構建了PMDL8TIL21重組克隆載體，且無基因突變。2重組表達載體PET30AIL一21的構建及對RHLL21表達條件的優(yōu)化

簡介：華中科技大學博士學位論文X射線和喜樹堿對外周血淋巴細胞不同細胞亞群生物學效應的研究姓名田銘申請學位級別博士專業(yè)生物化學與分子生物學指導教師龔建平201104華中科技大學博士學位論文華中科技大學博士學位論文2殖期的PBLSΓH2AX表達較靜止期多，這表明增殖期PBLS較靜止期損傷更明顯，放化療敏感性更顯著。同時我們通過兩組凋亡率的比較也發(fā)現(xiàn)，增殖期細胞的死亡更多，其相關蛋白BCL2，CASPASE9和CASPASE3的表達也與該現(xiàn)象相符。為了明確H2AX在上述生物過程中的作用，通過RNAI技術在293T中抑制H2AX的表達，發(fā)現(xiàn)其對CPT和XRAY誘導的凋亡無顯著影響，故H2AX可能僅作為DNA損傷的標志蛋白，而不參與凋亡途徑的調控。本研究旨在通過以正常人的PBLS為模型模擬腫瘤細胞的不同細胞亞群，研究損傷因子（XRAY和CPT）對不同細胞周期狀態(tài)的亞群細胞（靜止期和增殖期）的DNA損傷修復應答反應和細胞凋亡的影響，進一步揭示不同細胞周期狀態(tài)的亞群細胞在外界損傷因子誘導的DNA損傷以及細胞凋亡方面存在明顯的差異，靜止期細胞容易逃避外界因子引起的DNA損傷，這對于指導臨床腫瘤治療有重要意義。

簡介：點擊查看更多CCN3在低血清誘導軟骨終板細胞凋亡體系中的表達及生物學作用.pdf精彩內容。

簡介：目的體外分離、培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞UMBILICALCDDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLS，UCMSCS，并檢測細胞表面標志物CD309（血管內皮細胞生長因子受體2，VEGFR2，F(xiàn)LK1）的表達，細胞分泌肝細胞生長因子HGF和前列腺素E2PGE2的量，分別分析它們與供者信息產婦年齡、孕周、胎兒體重和性別的相關性。方法無菌條件下收集健康胎兒臍帶，采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)UCMSCS，并進行傳代培養(yǎng)。觀察細胞形態(tài)，細胞計數(shù)儀檢測收獲細胞數(shù)量，繪制生長曲線，流式細胞儀檢測免疫表型，成骨成脂誘導分化鑒定。流式細胞儀檢測培養(yǎng)的82份P1代細胞表面標志物CD309表達。隨機抽取15份UCMSCS傳代培養(yǎng)至P11代。ELISA法分別檢測P1、P3、P5、P7、P10和P11代UCMSCS培養(yǎng)上清中細胞因子HGF和PGE2的含量。隨機抽取28份UCMSCS擴增培養(yǎng)，P2代細胞接種后培養(yǎng)48小時收獲，細胞計數(shù)儀檢測細胞數(shù)量，分析細胞增殖能力和供者信息（產婦年齡、孕周、胎兒體重、性別和分娩方式）的相關性。結果培養(yǎng)的臍帶間充質干細胞貼壁生長，呈梭形或紡錘形，傳代細胞形態(tài)均一，可連續(xù)傳至15代以上。通過檢測原代，P3代，P10代細胞在不同生長時間細胞增殖量，繪制出生長曲線。P1代、P3代和P7代UCMSCS的細胞表型均為CD90CD105CD166CD14CD34CD45CD79AHLADR。P3代細胞分別通過成骨和成脂誘導分化培養(yǎng)，誘導分化成骨細胞和脂肪細胞。不同供者來源UCMGCS的P1代細胞表面標志物CD309表達范圍為0％160％N82，P1代細胞CD309表達率越高，其細胞增殖倍數(shù)越高。P3代上清中HGF和PGE2含量分別為26029±11680PGML、3046±841PGMLN15，P5代上清中HGF和PGE2含量分別為11660±5137PGML、2396±569PGMLN15。從P1代傳代培養(yǎng)至P11代，細胞培養(yǎng)上清中HGF含量隨傳代次數(shù)降低，PGE2含量無顯著性變化。擴增培養(yǎng)28份UCMSCS獲得細胞增殖倍數(shù)，分析發(fā)現(xiàn)產婦年齡2426歲組增殖倍數(shù)為439±115，比3141歲組增殖倍數(shù)299±075高男性胎兒增殖倍數(shù)為392±117，比女性胎兒增殖倍數(shù)303±087高胎兒體重＜35KG組增殖倍數(shù)為389±092，比≥35KG組增殖倍數(shù)287±119高細胞增殖能力均是前者強于后者孕周和分娩方式的不同細胞增殖能力無顯著性差異。結論本實驗成功分離培養(yǎng)出人臍帶間充質干細胞，并傳代擴增。不同供者來源UCMSCS細胞表面標志物CD309表達存在差異，高表達CD309的UCMSCS細胞增殖能力更強。不同供者來源UCMSCS分泌HGF和PEG2的量也有較大差異。隨傳代次數(shù)增加，細胞分泌的HGF量降低，P5代出現(xiàn)急劇下降，而PGE2量無明顯變化。產婦年齡較小、胎兒體重較輕的男性胎兒的UCMSCS細胞增殖能力更強。

簡介：中圖分類號Q2墨UDC500碩士學位論文學校代碼Q§三三密級公玨0D38在鼻咽癌側群細胞中高表達并通過影響ZAP70信號通路發(fā)揮其生物學效應CD38ISHIGHLYEXPRESSEDINSIDEPOPULMIONCELLSOF●一一一一HUMANNASOPHARYNGEALCARCINOMACELLLINESANDPLAYSAROLEBYSYNERGIZINGWITHZAP70作者姓名學科專業(yè)研究方向學院系、所指導教師鄭丹薇生物學細胞生物學腫瘤研究所周艷宏論文答辯日期翌呈鄉(xiāng)答辯委員會主席暨莖J{一中南大學2014年5月本課題受如下基金項目資助2013年國家自然科學基金重大項目項目批準號912291222013年國家自然科學基金面上項目項目批準號812729752012年湖南省自然科學基金重點項目項目批準號12JJ20442012年湖南省發(fā)改委項目LTF遺傳變異影響鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究

簡介：分類號～ⅦDC密級編號午I初大學CENTRALSOUTHUNIVERSITY碩士學位論文論文題目人胃腸薏霎曩燃SHD學科、專業(yè)研究生導師姓名及其專業(yè)技術職稱普通外科劉盛廖國慶教授中南大學二。一一年五月分類號VDC碩士學位論文密級舢F||IL||FL|L|I|LL|LL|IIIIF|ILFI『IIL|L|1|刪Y1916725人胃腸道間質瘤細胞系GISTH1的生物學特性觀察OBSERVATIONSONBIOLOGICALCHARACTERISTICSOFTHEHUMANGASTROINTESTINALSTROMAL11UMORCENLINEGIST_H1作者姓名劉盛學科專業(yè)普通外科學院系、所湘雅醫(yī)院指導教師廖國慶教授論文答辯日期2殳2答辯委員會主席中南大學二。一一年五月

簡介：排汗是皮膚的重要功能之一，皮膚通過排汗來維持基礎代謝體溫。汗腺是皮膚的一個附屬機構，是排汗的承擔者，沒有汗腺的皮膚如疤痕等不能排汗。隨著醫(yī)療衛(wèi)生改革和居民生活水平的提高，大面積深度燒傷病人存活率越來越高。大面積深度燒傷病人的燒傷面積可達98，病人傷愈后，在創(chuàng)面形成疤痕組織，而疤痕組織不含有汗腺，不能排汗，大大影響了病人的生活質量。如何再生足夠量的汗腺，使病人皮膚排汗功能修復，是臨床上亟待解決的問題。由于大面積深度燒傷病人的燒傷面積很大，不可能從病人身上取得大量的汗腺細胞，所以汗腺細胞的來源很少，并且汗腺細胞是體細胞，在體外難以實施擴增培養(yǎng)。所以本論文旨在通過體外分離獲得人汗腺細胞，繼而構建人汗腺細胞來源的IPS，為獲得大量的修復汗腺的種子細胞奠定基礎。第一部分人汗腺細胞的分離、體外培養(yǎng)及鑒定目的從外科手術廢棄的幼兒六指皮膚中分離獲得汗腺細胞，建立體外培養(yǎng)傳代方法，并對其生物學特性進行鑒定。方法將幼兒六指皮膚除去脂肪和結締組織，剪成1MM2大小，用IV型膠原酶于37℃消化4H，在倒置顯微鏡下提取出汗腺。將汗腺干貼于6CM細胞培養(yǎng)皿中，加入汗腺細胞培養(yǎng)基于37℃、5CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。23D后，細胞從汗腺中長出。RTPCR和免疫熒光染色技術檢測汗腺細胞的標志基因和蛋白質CEA、CK14和CK18的表達。結果人汗腺細胞呈典型的上皮細胞樣生長，排列緊密，類似鋪石路狀，細胞邊界明顯，核清晰；RTPCR和免疫熒光染色技術結果顯示，分離培養(yǎng)的細胞表達汗腺細胞的標志基因和蛋白CEA、CK14和CK18。結論成功建立人汗腺細胞的分離和體外培養(yǎng)體系，并對其生物學特性進行初步鑒定，為進一步研究汗腺細胞奠定了物質基礎。第二部分人汗腺細胞來源的IPS制備及生物學特性鑒定目的重編程人汗腺細胞為誘導多能性干細胞，并對其生物學特性進行初步分析。方法取體外培養(yǎng)10D后的汗腺細胞，以1105的密度接種于6CM細胞培養(yǎng)皿中。第二天，加入含有4種胚胎干細胞的轉錄因子基因OCT4、SOX2、KLF4和CMYC的慢病毒的無血清培養(yǎng)基。23D后，消化接種到鋪有滋養(yǎng)層細胞的6CM細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)約10D后，挑選克隆和細胞形態(tài)與HESC相同的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細胞的24孔板中。培養(yǎng)約10D后，再次挑選克隆和細胞形態(tài)與HESC相同的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細胞的6孔板中。RTPCR檢測誘導后的細胞OCT4、SOX2、KLF4、CMYC和NANONG基因表達，免疫熒光技術分析4因子轉染細胞對HESC標志物OCT4、SSEA3、SSEA4、TRA160和TRA181的表達。結果（1）人汗腺細胞經慢病毒轉染后細胞形態(tài)改變，與汗腺細胞差異顯著，形成的IPS克隆，形態(tài)與HESC形態(tài)相似，細胞生長緊密，邊界不明顯，核質比高，核仁清新，在細胞周圍有大量代謝產物；（2）RTPCR顯示汗腺細胞來源的IPS表達基因OCT4、SOX2、KLF4、CMYC和NANOG；（3）免疫熒光技術顯示汗腺細胞來源的IPS的OCT4、SSEA3、SSEA4、TRA160和TRA181蛋白質表達呈陽性。結論人汗腺細胞經4因子轉染后，成功構建IPS，人汗腺細胞源IPS表達HESC標志基因和相關分子。

簡介：INNUENCEOFAMMONIANITROGENANDNITRITENITROGENONTHMORCEUBIOLOGYADISSERTATIONSUBMI慨DTOMEGRADUATESCHOOLOFHENANUNIVERSI夠MP枷ALFUL舢MENTOFMEREQU沁M咄FORTILEDE舯EOFM嬲TEROFMEDICIILEBY三覷拖ESUPERVISORPRO￡HU鋤GMCHAOSHENAPRIL，2014摘要隨著農業(yè)化肥，工業(yè)防腐劑的廣泛應用，自然界水體和土壤中氨氮，硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮含量逐年增加。亞硝酸鹽是常見的亞硝態(tài)氮，硫酸銨是常用的化肥，近年來在環(huán)境中負荷不斷加大。與此同時，流行病學研究顯示，氨氮污染嚴重的地區(qū)癌的發(fā)病率和死亡率逐步增高，尤其是肺癌近年來最為嚴重。深入研究氨氮與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關系有非常重要的意義。目的選擇肺癌為研究對象，氨氮及亞硝酸鹽對于肺癌細胞演變的生物學作用。在模擬的腫瘤微環(huán)境中研究氨氮及亞硝態(tài)氮對于肺癌細胞的侵襲作用所起的作用。為進一步了解亞硝酸鹽和肺癌的關系補充依據(jù)。方法用小鼠成纖維細胞L929和小鼠肺癌細胞LLC細胞共培養(yǎng)，體外模擬腫瘤微環(huán)境，制作細胞模型。免疫細胞化學法檢測Q平滑肌肌動蛋白Ⅱ一SMA表達；以亞硝酸鈉代表亞硝態(tài)氮，以硫酸銨代表氨氮。體外細胞增殖指標采用MTT細胞增殖活性；PI染色流式細胞術分析細胞周期；HOECHST33258熒光染色計數(shù)細胞分裂指數(shù)；細胞遷移和侵襲能力判定采用劃痕實驗和TRALLSWELL侵襲實驗，結合細胞爬片細胞形態(tài)變化判定上皮問質轉化EPITHELIALTOMESENC塒MALTRANSITION，EMT的發(fā)生。免疫熒光法檢測活性氧的含量。結果MTT結果顯示對LLC細胞，亞硝酸鈉、硫酸銨、亞硝酸鈉硫酸銨混合液有濃度依賴性增殖抑制作用氏O05，亞硝酸鈉在08MG。L～一10MGL～，細胞增殖有小幅增加；硫酸銨濃度在10MGL～18MGL～，細胞增殖有小幅增加；亞硝酸鈉和硫酸銨混合液對細胞增殖抑制作用明顯比單純亞硝酸鈉組和硫酸銨組低PLO05；對L929細胞，亞硝酸鈉在08MGL～1OMGL。1濃度范圍內，硫酸銨在1OMGL～18MGL‘1范圍內對細胞增殖有促進作用；對LLC或L929細胞的促增殖作用，相同劑量，相同時間條件下，硫酸銨作用強于亞硝酸鈉尸005；亞硝酸鈉或硫酸銨對L929細胞促增殖作用強于LLC尸0。05。將L929和LLC細胞共培養(yǎng)L929LLC模擬腫瘤微環(huán)境，經免疫組化法檢測到共培養(yǎng)體系中一些細胞的Q平滑肌肌動蛋白QSMA表達呈陽性，證實這些細胞已轉化為腫瘤相關成纖維細胞CARCINOMAASSOCIATED

簡介：脊髓損傷SPINALCDINJURYSCI不可避免造成神經元死亡及其軸突斷裂進而導致神經支配功能的喪失。支持和引導軸突生長是SCI修復的關鍵。作為支持和引導損傷神經元軸突生長的移植細胞嗅鞘細胞OLFACTYENSHEATHINGCELLSOECS具有天然的優(yōu)勢。然而SCI后膠質細胞表達的抑制分子形成抑制軸突再生的化學屏障膠質細胞活化遷移在損傷部位形成的膠質瘢痕和空洞缺損成為軸突再生的物理屏障。在此環(huán)境中移植細胞難以定向遷移和有序分布無法為再生軸突提供有效的支持和引導這是細胞移植修復SCI難以取得突破的重要原因。因此通過組織工程構建仿生支架定向分布移植細胞克服損傷部位抑制分子和瘢痕空洞對軸突再生的不利影響為神經元軸突再生提供支持和引導成為實現(xiàn)SCI功能修復的重要突破口也是目前SCI修復的研究熱點。選擇性能優(yōu)異的生物材料是研究的前提。絲素蛋白SILKFIBROINSF以其優(yōu)異的生物相容性、良好的力學性能、可控的降解和可塑性能逐漸被研究者認知。支架仿生構建關鍵在于對基質材料納米結構的調控。近年來SF的自組裝機制和納米結構調控研究取得重大進展。基于SF自組裝機制的研究本項目組獲得結構均一的納米線結構單元發(fā)現(xiàn)該納米線結構對SF靜電紡絲過程的纖維直徑及走向具有重要影響可以使得SF納米纖維的直徑更為可控、取向更為有序。因此作為組織工程支架的基質材料SF具有天然的優(yōu)勢。為探討SF納米纖維材料作為定向分布OECS的移植載體的可行性本課題就以下幾方面內容進行探討1建立OEC培養(yǎng)體系倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)周期內細胞形態(tài)的變化活細胞工作站觀察OECS連續(xù)動態(tài)的形態(tài)變化明確同一培養(yǎng)條件下OECS遷移運動的形態(tài)特征及其變化規(guī)律。2研究不同培養(yǎng)條件有或無血清不同增殖劑FSKOLIN或BFGF對OECS的形態(tài)及其遷移能力的影響明確不同培養(yǎng)條件下OECS遷移運動的形態(tài)特征及其變化規(guī)律分析OECS遷移的調控機制。3靜電紡絲工藝制備桑蠶絲BSF和柞蠶絲TSF納米纖維支架檢測比較并評價兩種支架材料對OECS的形態(tài)、增殖、存活及其表型的影響明確SF納米纖維支架的生物相容性及其優(yōu)越性的具體體現(xiàn)。4掃描電鏡觀察SF支架及細胞的超微結構光鏡下觀察細胞的形態(tài)及其分布免疫熒光染色顯示細胞表型及細胞骨架的發(fā)育活細胞工作站連續(xù)動態(tài)觀察細胞形態(tài)特征明確其變化規(guī)律分析細胞遷移軌跡、遷移速度、遷移速率等研究靜電紡SF納米纖維支架的不同種類TSF與BSF、不同直徑400NM和1200NM和不同取向分布平行有序排列和無序網(wǎng)絡狀及空間拓撲結構對OECS遷移運動的影響明確SF納米纖維支架定向分布OECS的調控作用及其機制。5RTPCR檢測OECS的MBP、NGF、GDNF、BDNF、NCAM、VEGF的基因表達ELISA檢測培養(yǎng)液上清中的蛋白含量明確SF納米纖維定向分布的OECS表達功能基因和蛋白量的變化分析其神經營養(yǎng)功能。6探討SF納米纖維定向分布OECS對神經元生長發(fā)育的影響明確定向分布OECS的生物學功能為進一步優(yōu)化設計及其應用提供理論基礎和實驗依據(jù)。通過上述研究本課題得出如下結論并分析其原因、意義及啟示1通過活細胞工作站連續(xù)動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)在同一培養(yǎng)條件下OECS遷移過程中表現(xiàn)出多樣性變化的形態(tài)特征。分析細胞形態(tài)變化與遷移運動之間的關系明確OECS多樣性的形態(tài)表現(xiàn)是由其功能狀態(tài)決定的不同形態(tài)的OECS適應不同的功能狀態(tài)細長突起及梭形胞體形態(tài)有利于細胞遷移運動扁平狀有利于胞體鋪展黏附圓球狀有利于細胞生長增殖。OECS遷移運動的形態(tài)特征及其變化規(guī)律更加合理地解釋OECS的形態(tài)多樣性。在電鏡、光鏡和免疫染色觀察細胞的形態(tài)都是相對靜止和固定的因而難以區(qū)分和正確理解細胞形態(tài)的多樣性是由于細胞適應其自身功能需要而形變的結果。進一步明確OECS形態(tài)變化與遷移運動功能之間的相互關系有助于理解OECS遷移的調控機制。2通過研究不同培養(yǎng)條件對OECS的形態(tài)及其遷移能力的影響明確OECS具有優(yōu)異的可塑性。OECS自胞體伸出微小突起感知周圍環(huán)境信號變化從而改變自身形態(tài)以適應環(huán)境變化進而實現(xiàn)細胞不同功能的表達。無血清條件培養(yǎng)液、FSKOLIN和BFGF有利于OECS運動功能的表達提高了細胞的遷移速度。由于OECS遷移缺乏有效引導遷移軌跡和遷移方向是隨機和無規(guī)律性的呈現(xiàn)無規(guī)行走。實現(xiàn)信號分子的濃度梯度分布或是構建模擬細胞外基質三維納米空間結構的仿生支架是體外引導和調控細胞定向遷移的有效途徑。3SF尤其是TSF納米纖維支架具有良好的生物相容性能夠促進OECS黏附、生長與增殖。分析原因SF納米纖維支架高的表面與體積比率、表面活性和優(yōu)異的親水性能有利于支架材料吸附培養(yǎng)液中的蛋白質分子和其它生物活性物質從而促進細胞在支架表面黏附進而有利于細胞的存活、生長與增殖。TSF納米纖維具有更為優(yōu)異的生物相容性與其含有豐富的精氨酸甘氨酸天冬氨酸RGD三肽序列有關RGD序列是人類細胞外基質中廣泛存在的能夠被細胞表面受體識別和特異性結合的序列作為細胞膜整合素受體與細胞外配體相結合的識別位點介導細胞與細胞外基質及細胞之間的相互作用能夠促進細胞對支架的黏附進而促進細胞的生長與增殖。TSF富含RGD三肽的特性賦予其更為優(yōu)異的生物學性能。4SF納米纖維的直徑、取向分布及空間拓撲結構對定向分布OECS的調控作用。OECS對BSF和TSF納米纖維的不同直徑大小、取向分布及三維空間拓撲結構存在不同的生物學響應。小直徑400納米對促進細胞的黏附、生長、增殖及遷移都有更為優(yōu)異的表現(xiàn)。分析原因OECS依賴于其突起尋路及附著其細小的突起更容易黏附于小直徑的納米纖維之上進而有利于實現(xiàn)細胞的生長、增殖及遷移等生物學功能。平行排列的納米纖維有利于引導和調控細胞遷移軌跡和方向細胞沿納米纖維的取向形成有序分布在同一根纖維上細胞間的突起相互連接從而細長串珠樣結構。分析原因平行排列的納米纖維結構能夠使細胞的突起在尋路過程中不易被其它纖維或細胞影響和干擾因而在遷移過程中能夠保持較好的方向性引導細胞在支架材料上定向遷移并有序分布。從超微結構觀察細胞在支架三維拓撲結構中的狀態(tài)能夠提示支架的孔隙大小、纖維間的距離及排列方式對細胞的形態(tài)及功能也有重要影響這對于構建體內應用的支架有著重要的啟示意義。目前SF納米纖維的直徑能夠控制在50納米級別同時纖維取向分布更為有序今后將更為深入探討纖維直徑、取向及三維空間拓撲結構對OECS生物學行為的影響以進一步優(yōu)化支架的結構設計。5SF納米纖維調控OECS定向遷移和有序分布與細胞骨架的排列方式密切相關。從細胞骨架形態(tài)及其分布的觀察可以看出生長在SF納米纖維上的OECS細胞骨架發(fā)育理想微管蛋白排列整齊表明細胞可以感受生長環(huán)境對SF納米纖維支架具有很好的反應而且對小直徑平行排列的TSF納米纖維的反應更強。同時提示OECS對基質環(huán)境的響應是通過調控細胞骨架的形成及其架構從而控制細胞的形態(tài)變化如突起的延伸及回縮胞體的形變進而促進細胞的遷移并控制細胞遷移的方向引導細胞在支架材料上形成有序分布。6TSF納米纖維支架有利于OECS功能基因和蛋白的表達。TSF納米纖維支架為細胞提供的生長環(huán)境有利于細胞合成與分泌細胞外基質成分、細胞黏附分子及可溶性趨化因子使得細胞能夠在支架上遷移和相互聚集細胞間形成更多的通訊聯(lián)接。同時TSF納米纖維支架促進細胞分泌細胞外基質的作用還可以進一步促進細胞的生長與增殖。7定向分布OECS支持神經元生長發(fā)育引導神經元軸突延伸。支持和引導神經元及其軸突的生長及延伸是OECS在體內嗅覺神經元生長發(fā)育及損傷再生過程中作為細胞底物作用的關鍵也是其應用于移植修復SCI的重要理論基礎。體外構建SF仿生支架定向分布OECS支持神經元生長發(fā)育引導神經元軸突延伸是本課題研究的目的也是其研究價值的核心體現(xiàn)。天然細胞外基質的纖維尺寸為50500NM進一步控制納米纖維的直徑及取向最大程度地仿生體內細胞外基質結構是今后研究的重要內容?；赟F自組裝機制研究的突破具有天然細胞外基質膠原納米纖維結構的SF納米纖維水凝膠的成型機理及其制備技術是本課題今后的研究方向。此外利用SF納米纖維載藥緩釋技術負載相關蛋白因子賦予支架生物活性是實現(xiàn)SF仿生支架修復SCI取得突破的重要環(huán)節(jié)。

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簡介：分類號密級單位代碼10114學號200910071NFKB抑制劑對宮頸癌細胞株生物學特性的影響研究指導教師昱塞墓熬撞申請學位門類級別科堂堂僮專業(yè)名稱塑亡整堂研究方向塑科鼬瘙所在學院出酉醫(yī)科太堂篁二監(jiān)鏖醫(yī)堂隨2012年3月18日目錄中文摘要I英文摘要II英文名詞縮略表Ⅲ1上一JL刖舌1第一部分MIF、NFKB在人兩種不同宮頸癌細胞株中的表達實驗一免疫細胞化學檢測MIF、NF迅在人兩種不同宮頸癌細胞株中的表達3實驗二WESTEMBLOTTING法檢測MIF、NFKB在人兩種不同宮頸癌細胞株中的表達5實驗三ELISA檢測MIF、NF1B在人兩種不同宮頸癌細胞株上清液中的表達9討論10第二部分NFKB抑制劑PDTC對人宮頸癌細胞株CASKI細胞增殖及趨化能力的影響實驗一MTT法觀察PDTC對人宮頸癌細胞株CASKI細胞增殖能力的影響13實驗二BOYDEN小室觀察PDTC對人宮頸癌CASKI細胞趨化能力的影響15討論16第三部分NFKB抑制劑PDTC對MIF及轉移相關因子在人宮頸癌細胞株CASL【I細胞中的表達的影響實驗一免疫細胞化學法檢測PDTC干預CASKI細胞中MIF及轉移相關因子的表達18實驗二WESTERNBLOTTING法檢測PDTC干預CASKI細胞中MIF及轉移相關因子的表達一20實驗三ELISA法檢PDTC干預CASKI細胞中MIF及轉移相關因子的蛋白含量的變化22討論23結論25參考文獻26綜述29個人簡介35致謝36

簡介：第三軍醫(yī)大學研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明秉承學校嚴謹?shù)男ｏL和科研作風，本人申明所呈交的論文是我本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C構的學位或證書而使用過的材料，與我同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請學位論文與資料若有不實之處，本人承擔一切相關責任。論文作者簽名駐日期之必業(yè)第三軍醫(yī)大學研究生學位論文版權使用授權書本人完全了解第三軍醫(yī)大學有關保護知識產權的規(guī)定，即研究生在攻讀學位期間論文工作的知識產權單位屬第三軍醫(yī)大學。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為第三軍醫(yī)大學。學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內容保密內容除外，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名翌邀指導教師簽名旦2翌主璽日期山I；∞IY55小結79全文總結80參考文獻8L文獻綜述自噬與凋亡之間的平衡與腫瘤一90參考文獻一99博士期間發(fā)表及待發(fā)表文章109致謝110

簡介：目的聯(lián)合采用免疫磁珠及流式細胞術分選豬骨髓極小胚胎樣干細胞VSELS鑒定其生物學特性，并探尋體外培養(yǎng)、擴增豬骨髓VSELS的方法。方法常規(guī)消毒、麻醉后穿刺豬髂后上棘獲取骨髓，使用紅細胞裂解法獲得豬骨髓單個核細胞，運用分別耦合了CD133和LIN抗體的磁珠進行免疫磁珠分選，對所得的CD133細胞群和LIN細胞群標記熒光抗體CD133、CD45及LIN，進一步通過流式細胞術分選獲得VSELS，使用統(tǒng)計學方法分析兩種分選方法的效率，并探討聯(lián)合分選的價值使用光學顯微鏡及透射電鏡觀察豬骨髓VSELS的形態(tài)特征和超微結構，運用堿性磷酸酶染色和免疫熒光染色的方法鑒定其多能干細胞標志的表達同時采用條件培養(yǎng)基對豬骨髓VSELS進行培養(yǎng)擴增，觀察VSELS的貼壁及增殖情況。結果聯(lián)合采用免疫磁珠與流式細胞分選術能夠高效的分選出豬骨髓VSELS，且使用CD133陽性分選較LIN陰性分選效率更高，但聯(lián)合分選有費用高昂、細胞容易污染等缺點豬骨髓VSELS約占總單個核細胞數(shù)量的001％003％，該細胞體積較小、形態(tài)均一，呈二倍體核型、核大而細胞質少、核質比高，能夠表達多能抗原標志OCT4、NANOG和SOX2，同時堿性磷酸酶染色陽性VSELS經條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后34小時可見細胞貼壁，培養(yǎng)23周仍無明顯增殖。結論免疫磁珠及流式細胞術能夠快速的從豬骨髓中分選出數(shù)量較多、純度較高的VSELS該細胞能表達胚胎樣干細胞的特異性抗原標志，其生物學特性類似于胚胎干細胞，不易于體外培養(yǎng)、擴增。

簡介：學位論文脂聯(lián)素對人乳腺癌脂聯(lián)素對人乳腺癌MCFMCF7細胞生物學行為的影響及其細胞生物學行為的影響及其所誘導的凋亡與自噬相關性的研究所誘導的凋亡與自噬相關性的研究THEEFFECTOFADIPONECTINONTHEBIOLOGYTHEEFFECTOFADIPONECTINONTHEBIOLOGYBEHAVIORSOFTHEMCFBEHAVIORSOFTHEMCF7CELLANDTHERELATIONSHIP7CELLANDTHERELATIONSHIPOFTHEINDUCEDAPOPTOSISANDAUTOPHAGYOFTHEINDUCEDAPOPTOSISANDAUTOPHAGY劉佳2015年05月UDC編號指導教師姓名指導教師姓名王佑民教授安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院申請學位級別申請學位級別碩士專業(yè)名專業(yè)名稱內科學（內分泌與代謝?。┨峤徽撐娜掌谔峤徽撐娜掌?0150317論文答辯日期論文答辯日期20150510學位授予單位和日期學位授予單位和日期安徽醫(yī)科大學答辯委員會主席答辯委員會主席評閱人安徽醫(yī)科大學ANHUIMEDICALUNIVERSITY碩士學位論文脂聯(lián)素對人乳腺癌脂聯(lián)素對人乳腺癌MCFMCF7細胞生物學行為的影響及其細胞生物學行為的影響及其所誘導的凋亡與自噬相關性的研究所誘導的凋亡與自噬相關性的研究THEEFFECTOFADIPONECTINONTHEBIOLOGYTHEEFFECTOFADIPONECTINONTHEBIOLOGYBEHAVIORSBEHAVIORSOFTHEMCFOFTHEMCF7CELLANDTHERELATIONSHIP7CELLANDTHERELATIONSHIPOFTHEINDUCEDAPOPTOSISANDAUTOPHAGYOFTHEINDUCEDAPOPTOSISANDAUTOPHAGY作者姓名作者姓名劉佳指導教師指導教師王佑民王佑民教授教授學科、專業(yè)學科、專業(yè)內科學科學（內分泌與代謝病）（內分泌與代謝?。┭芯糠较蜓芯糠较蛱悄虿∨c腫瘤糖尿病與腫瘤論文工作時間論文工作時間2013年9月至月至2015年3月