簡介：背景1、制造小口徑組織工程血管是當前的研究熱點仿生應力對小口徑組織工程血管的生長和成熟非常重要但目前的很多灌注培養(yǎng)式生物反應器尚不能提供模擬生理血流的動力學環(huán)境而且未提供足夠的生物學數(shù)據(jù)來證明其優(yōu)越性2、小口徑組織工程血管的功能和生物力學特性都離不開平滑肌細胞的良好增殖但平滑肌細胞在接種到支架材料后的增殖情況并不令人滿意從而影響小口徑組織工程血管的功能和生物力學強度。目的1、構(gòu)建小口徑組織工程血管體外仿生搏動流體應力條件下進行培養(yǎng)觀察對小口徑組織工程血管的生物學作用2、構(gòu)建平滑肌細胞受仿生搏動應力模型探討仿生搏動應力促平滑肌細胞增殖的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制。方法1、1酶消化法分離獲得內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞顯微鏡觀察細胞形態(tài)VIII因子相關抗原免疫組化染色和Α肌動蛋白免疫熒光染色分別鑒定內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的表型2用不使用胰酶的化學方法制備脫細胞兔主動脈支架材料觀察大體形態(tài)行組織學觀察、掃描電鏡和透射電鏡觀察CCK8法評價生物相容性計算接種細胞黏附率評價親水性接種內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞后行組織學觀察、掃描電鏡和透射電鏡觀察3內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞接種到脫細胞兔主動脈構(gòu)建小口徑組織工程血管置入我們自行研制的小口徑組織工程血管生物反應器分別給予仿生搏動流體應力和靜態(tài)培養(yǎng)后檢測觀察大體形態(tài)行HE染色、MASSON染色和彈力纖維染色掃描電鏡觀察REALTIMEPCR檢測COLLAGENI、III、IV、堿性成纖維細胞生長因子和內(nèi)皮素1MRNA表達免疫熒光檢測鈣調(diào)蛋白、Α肌動蛋白、VIII因子相關抗原和血管性假性血友病因子NO和6KETOPGF1A濃度檢測血小板黏附實驗生物力學檢測。2、1分組①動態(tài)培養(yǎng)組②靜態(tài)培養(yǎng)組③動態(tài)培養(yǎng)慢病毒組④靜態(tài)培養(yǎng)慢病毒組⑤動態(tài)培養(yǎng)IGF1RSIRNA組⑥靜態(tài)培養(yǎng)IGF1RSIRNA組。檢測細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡REALTIMEPCR檢測IGF1R、骨橋蛋白MRNAWESTERNBLOT檢測IGF1R、骨橋蛋白、PTYRIGF1R、PAKT2分組①動態(tài)培養(yǎng)組②靜態(tài)培養(yǎng)組。檢測MICRNA芯片檢測MICRNA數(shù)據(jù)庫預測REALTIMEPCR檢測差異表達的MICRNA3分組①動態(tài)培養(yǎng)組②靜態(tài)培養(yǎng)組③動態(tài)培養(yǎng)慢病毒組④靜態(tài)培養(yǎng)慢病毒組⑤動態(tài)培養(yǎng)MICRNA223組⑥靜態(tài)培養(yǎng)MICRNA223組⑦動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153組⑧靜態(tài)培養(yǎng)MICRNA153組。檢測靶基因驗證實驗、細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡REALTIMEPCR檢測IGF1R、骨橋蛋白MRNAWESTERNBLOT檢測IGF1R、骨橋蛋白、PTYRIGF1R、PAKT。結(jié)果1、1平滑肌細胞成束平行的排列呈典型的“峰與谷”樣生長Α肌動蛋白免疫熒光呈現(xiàn)強陽性內(nèi)皮細胞呈典型的“鵝卵石”樣生長排列密集VIII因子相關抗原免疫組化染色為強陽性2①脫細胞兔主動脈質(zhì)地與新鮮兔主動脈相比無明顯變化②HE染色結(jié)構(gòu)疏松質(zhì)地均勻自身細胞基本完全脫除MASSON染色結(jié)構(gòu)疏松膠原纖維之間可見較多空隙彈力纖維染色結(jié)構(gòu)疏松彈力纖維之間可見較多空隙③掃描電鏡檢測外表面毛糙主要由粗大的膠原纖維交織而成孔隙比內(nèi)表面多內(nèi)表面光滑④對平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的細胞毒性評價為01級⑤平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的黏附率分別為6432％±203和5277±119⑥種子細胞脫細胞兔主動脈復合物的檢測HE染色平滑肌細胞生長良好并有部分遷移至管壁內(nèi)部內(nèi)皮細胞附著于內(nèi)表面生長良好掃描電鏡外表面和內(nèi)表面均被平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞附著并且部分平滑肌細胞向支架表面的孔隙內(nèi)生長透射電鏡平滑肌細胞胞漿內(nèi)富含肌絲縱向平行排列胞內(nèi)有密斑和密體內(nèi)皮細胞間存在細胞連接胞漿內(nèi)可見WP小體⑦親水性浸泡15分鐘后吸水率227±212浸泡12小時后飽和519±23而后維持在這一水平3①仿生搏動流體應力培養(yǎng)的小口徑組織工程血管管腔通暢色澤與天然血管接近②HE染色仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管中平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞增殖的數(shù)量較靜態(tài)培養(yǎng)的數(shù)量更多③掃描電鏡仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管平滑肌細胞向鄰近的細胞伸出很多突起相連靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞沿著支架形成紡錘形狀細胞數(shù)量也非常少仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管管腔內(nèi)面形成更完整的單層內(nèi)皮細胞層并更廣泛的分布④彈力纖維染色天然血管和仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管中染色較為豐富MASSON染色膠原表達沒有顯著差異REALTIMEPCR檢測仿生搏動流體應力培養(yǎng)的平滑肌細胞COLLAGENI、III和IV基因表達水平明顯升高⑤免疫熒光檢測仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管中平滑肌細胞沿環(huán)形方向伸展排列CALPONIN和AACTIN免疫熒光強度更強數(shù)量更多仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管中內(nèi)皮細胞幾乎鋪滿管腔內(nèi)壁VIII因子相關抗原和血管性假性血友病因子免疫熒光強度更強內(nèi)皮細胞數(shù)量更多⑥REALTIMEPCR檢測仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管中堿性成纖維細胞生長因子和內(nèi)皮素1MRNA的表達較靜態(tài)培養(yǎng)明顯升高⑦NO和6KETOPGF1A檢測仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管的內(nèi)皮細胞能夠產(chǎn)生大量NO和6KETOPGF1A數(shù)量比靜態(tài)培養(yǎng)更接近天然血管⑧血小板黏附實驗在仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管的管腔內(nèi)面粘附的血小板很少⑨力學特性仿生搏動流體應力培養(yǎng)的血管的拉伸彈性恢復率、斷裂伸長率、抗拉強度明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)的血管。2、1①動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞相比較細胞增殖明顯增強凋亡明顯減弱動態(tài)培養(yǎng)干擾IGF1RMRNA翻譯后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細胞相比較細胞增殖明顯減弱凋亡明顯增強②REALTIMEPCR檢測動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞相比較IGF1RMRNA的表達明顯上調(diào)動態(tài)培養(yǎng)干擾IGF1RMRNA翻譯后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細胞相比較IGF1RMRNA的表達明顯下調(diào)③WESTERNBLOT檢測動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞相比較IGF1R、PTYRIGF1R、PAKT的表達明顯上調(diào)動態(tài)培養(yǎng)干擾IGF1RMRNA翻譯后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細胞相比較IGF1R、PTYRIGF1R、PAKT的表達明顯下調(diào)2①動態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細胞組中篩選出2個表達上調(diào)2倍以上的MICRNA6個表達下調(diào)2倍以上的MICRNA②REALTIMEPCR對芯片結(jié)果進行驗證MICRNA153的表達在動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞中約為靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞中的12MICRNA223的表達在動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞中約為靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞中的14③REALTIMEPCR檢測發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長MICRNA153和MICRNA223的表達呈下降趨勢并均在4小時達到最低此后MICRNA153和MICRNA223的表達一直維持在最低水平3①EGFPRFP報告系統(tǒng)結(jié)果顯示IGF1R是MICRNA153和MICRNA223作用的靶基因并且MICRNA223對靶基因IGF1R的調(diào)控作用強于MICRNA153②REALTIMEPCR檢測靜態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞與靜態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細胞相比較MICRNA153和MICRNA223的表達明顯上調(diào)上調(diào)約4倍左右動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞與靜態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞相比較MICRNA153和MICRNA223的表達明顯下調(diào)③動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞相比較細胞增殖明顯減弱凋亡明顯增強動態(tài)培養(yǎng)MICRNA223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞相比較細胞增殖減弱更加明顯凋亡增強更加明顯④REALTIMEPCR檢測動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞相比較IGF1RMRNA的表達無明顯差異動態(tài)培養(yǎng)MICRNA223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞相比較IGF1RMRNA的表達無明顯差異⑤WESTERNBLOT檢測動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞相比較IGF1R的表達明顯下調(diào)動態(tài)培養(yǎng)MICRNA223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞與動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細胞相比較IGF1R、PTYRIGF1R、PAKT的表達下調(diào)更加明顯。結(jié)論1、酶消化法分離內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞方法簡單可行細胞獲取率高獲得細胞的細胞形態(tài)和免疫表型符合內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的特征2、用不使用胰酶的化學方法制備脫細胞兔主動脈支架材料方法簡便可行制備的脫細胞兔主動脈支架材料的親水性、細胞黏附性、細胞相容性和組織學等特性均適合作為小口徑組織工程血管的支架材料3、仿生搏動流體應力可以有效促進平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞增殖并引導平滑肌細胞的同向排列和內(nèi)皮細胞的均勻分布可能會引導小口徑組織工程血管形成接近于天然血管的組織結(jié)構(gòu)仿生搏動流體應力可以有效促進膠原和彈力纖維的分泌可能會引導小口徑組織工程血管具備接近于天然血管的生物力學性能仿生搏動流體應力可以有效促進平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞成熟表型的表達和細胞因子的分泌可能會引導小口徑組織工程血管向天然血管的方向成熟分化仿生搏動流體應力可以有效促進內(nèi)皮細胞舒張血管和抗血栓形成功能的發(fā)揮可能會引導小口徑組織工程血管擁有接近于天然血管的舒張血管和抗血栓形成能力4、IGF1R的表達上調(diào)、活性及其下游信號通路激活在仿生搏動應力促進靜脈平滑肌細胞的增殖和減少其凋亡中起重要作用5、仿生搏動應力可以促進靜脈平滑肌細胞IGF1R相關的MICRNA223和MICRNA153表達下調(diào)仿生搏動應力作用4小時MICRNA223和MICRNA153下調(diào)幅度最大此后維持在這一表達水平6、MICRNA223和MICRNA153的表達下調(diào)在仿生搏動應力促進靜脈平滑肌細胞的增殖和減少其凋亡中通過上調(diào)IGF1R的表達、激活其活性及其下游信號通路起重要作用。

簡介：對本實驗室構(gòu)建并保存的具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌PET32AGGT進行了小試發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化；重組質(zhì)粒PETGGT穩(wěn)定性的鑒定；細胞固定化生物合成茶氨酸的研究；在30L發(fā)酵罐擴大生產(chǎn)工藝的初步研究。主要研究結(jié)果如下1、利用PIACKETTBURMAN實驗設計和響應面法進行了小試發(fā)酵的優(yōu)化實驗優(yōu)化培養(yǎng)基為葡萄糖1039GL、酵母提取物688GL、K2HPO4710GL、蛋白胨10GL、NACL10GL、MGSO47H2O1GL；優(yōu)化培養(yǎng)條件為初始PH732、培養(yǎng)時間667H、IPTG誘導溫度3151℃、裝液量50ML250ML、接種量1％、IPTG誘導時間4H。ΓGGT活性為464UML，茶氨酸的產(chǎn)量為3518GL，L谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為577％。2、該基因工程菌在連續(xù)傳代100代后，質(zhì)粒的目的基因片斷沒有缺失，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；但在無抗生素選擇壓力下，連續(xù)傳代20代后開始出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的細胞，連續(xù)傳代100代后18％的細胞含有正常質(zhì)粒，表現(xiàn)出一定的分裂不穩(wěn)定性。該基因工程菌在優(yōu)化培養(yǎng)基和優(yōu)化條件下的整個發(fā)酵過程中，始終表現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)和分裂穩(wěn)定性。3、確定了海藻酸鈉20GL固定化后005％戊二醛交聯(lián)的固定化方法，固定化細胞酶活回收率為792％。細胞經(jīng)固定化后操作穩(wěn)定性與貯存穩(wěn)定性較游離菌顯著提高。構(gòu)建了固定化細胞填充床反應器，茶氨酸連續(xù)生物合成的平均產(chǎn)量為2540GL，平均體積產(chǎn)率為635GLH。4、初步確立了該基因工程菌發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)的相關參數(shù)和培養(yǎng)方法30L發(fā)酵罐中加入12L優(yōu)化培養(yǎng)基，5％的接種量，加消泡劑磷酸丁酯5ML，轉(zhuǎn)速250RMIN，37℃發(fā)酵培養(yǎng)，并根據(jù)溶氧變化補料添加葡萄糖，當溶氧低于40％補料100ML葡萄塘10GL，滴加5MOLLNAOH控制發(fā)酵PH在73左右，6H后用005MMOLLIPTG誘導，315℃誘導4H。30L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)后該基因工程菌的細胞密度OD600值可以達到192，但ΓGGT活性僅為122UML，茶氨酸產(chǎn)量為806GL，L谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率僅為1322％。

簡介：目的通過研究不同代次人髓核細胞的形態(tài)、增殖活性和表型表達變化，篩選出組織工程椎間盤研究適宜的種子細胞，并研究轉(zhuǎn)化生長因子Β1TRANSFMINGGROWTHFACTΒ1，TGFΒ1和胰島素樣生長因子1INSULINLIKEGROWTHFACT1，IGF1對髓核細胞增殖和表型表達的影響，探討TGFΒ1和IGF1在組織工程椎間盤研究中的應用價值，通過制備聚乳酸羥基乙酸PLGA三維框架，將種子細胞與框架結(jié)合，體外構(gòu)建組織工程椎間盤。方法1從人正常和退變髓核組織分離培養(yǎng)髓核細胞，分別取不同代次細胞作為研究對象，通過光鏡和電鏡下觀察細胞形態(tài)，對生長曲線、MTT攝取等進行測定，RTPCR方法測定細胞的聚集蛋白聚糖AGGRECAN、Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白MRNA的表達，來確定組織工程椎間盤的種子細胞。2將人正常傳2代髓核細胞作為研究對象，采用MTT二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽法和RTPCR技術，探索TGFΒ1和IGF1對細胞的形態(tài)、增殖以及Ⅱ型膠原和AGGRECAN的調(diào)節(jié)作用，及其時效與量效的關系。3將人正常髓核細胞種植于聚乳酸羥基乙酸PLGA三維多孔框架，構(gòu)建了組織工程椎間盤，通過MTT攝取、激光共聚焦熒光顯微鏡及掃描電鏡的方法進行體外觀察。結(jié)果1體外培養(yǎng)條件下，可見退變髓核細胞排列較紊亂，粗面內(nèi)織網(wǎng)輕度擴張。在接種相同的細胞密度和相同的培養(yǎng)條件下，成人正常和退變髓核細胞的生長曲線存在差異；二者的MTT攝取在傳1代時差異均無顯著性P＞005，傳3、5代時差異具有統(tǒng)計學意義P＜005。不同代次正常髓核細胞比較，傳3代之前細胞形態(tài)良好，從傳4代起，部分細胞向長梭形演化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。生長曲線和MTT試驗提示傳3代之前的細胞增殖能力強。RTPCR實驗提示，正常髓核細胞前3代表達Ⅱ型膠原和AGGRECAN旺盛，從傳4代起開始減少，其中AGGRECAN減少更明顯；退變髓核細胞不僅表達Ⅱ型膠原和AGGRECAN，而且表達少量Ⅰ型膠原。2在1％血清條件下，TGFΒ1具有促增殖作用。在10％血清條件下，TGFΒ1和IGF1均能提高細胞的增殖活性，并且在各自一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量效應關系。二者聯(lián)合應用作用效果更顯著。10UGL、100UGLTGFΒ1組和100UGLIGF1在促進AGGRECAN和Ⅱ型膠原基因表達方面也作用顯著，其中，10UGL組TGFΒ1作用最明顯。3細胞種植于PLGA框架后，行MTT攝取實驗提示細胞框架復合體呈深藍著色，縱行剖開，可見藍色晶體均勻分布于整個材料支架內(nèi)部。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察可見大量紅色熒光著色的細胞貼附于支架結(jié)構(gòu)內(nèi)，掃描電鏡可見大量細胞貼附于支架內(nèi)，并可見少量細胞外基質(zhì)分泌。結(jié)論1本研究提示成人正常髓核細胞傳代后前3代細胞形態(tài)良好，增殖能力強，AGGRECAN和Ⅱ型膠原MRNA表達良好，適合作為組織工程椎間盤的種子細胞，而退變髓核細胞由于細胞活性較低，表型表達發(fā)生改變，不宜作為種子細胞。2TGFΒ1和IGF1對人正常髓核細胞具有維持形態(tài)、促進增殖和正常表型表達的作用，其中10UGLTGFΒ1和100UGLIGF1作用最顯著。3以人正常髓核細胞作為種子細胞，以PLGA作為三維框架，二者復合后細胞能夠在支架材料內(nèi)貼附、生長，為進一步體內(nèi)修復研究奠定良好的基礎。

簡介：如何構(gòu)建具有仿生天然細胞外基質(zhì)ECM結(jié)構(gòu)和功能的組織工程支架，一直是組織工程及再生醫(yī)學研究的熱點。區(qū)別于傳統(tǒng)紡絲，靜電紡絲是一種使帶電荷的聚合物溶液或熔體在靜電場中射流來制備聚合物納米級纖維的加工方法。以此技術制備的納米纖維支架，具有極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)，相對于傳統(tǒng)技術制備的材料支架能夠更好地模擬天然細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點?；陟o電紡絲技術的納米纖維有望成為理想的組織工程支架。生物相容性可以解釋為生物材料和人體組織接觸后，在材料組織界面發(fā)生一系列相互作用后最終被人體組織所接受的性能，生物相容性是生物材料研究中始終貫穿的主題。細胞培養(yǎng)法因其檢測生物相容性快速、簡便、重復性好又價廉的特點，在材料生物相容性評價中起著越來越重要的作用。本課題對基于靜電紡絲技術組織工程支架的生物相容性進行了初步研究。采用靜電紡絲技術制備了新型的有別于傳統(tǒng)技術的組織工程支架仿生天然細胞外基質(zhì)EXTRACELLULARMATRIX，ECM，如絲素蛋白靜電紡絲支架，殼聚糖膠原蛋白靜電紡絲復合支架等，MTT法檢測細胞粘附和增殖，SEM形態(tài)學觀察，在整體和細胞水平基礎上深入至分子水平，使用RTPCR分析了材料對內(nèi)皮細胞相關基因表達的影響。主要研究內(nèi)容與結(jié)論如下以六氟異丙醇為溶劑，采用靜電紡絲制備絲素蛋白納米纖維，體外接種內(nèi)皮細胞，MTT法結(jié)果顯示納米纖維能夠有效促進內(nèi)皮細胞的粘附和增殖。共培養(yǎng)1D、3D、5D和7D后，對照組內(nèi)皮細胞增殖3倍，材料組細胞增殖也達27倍。RTPCR檢測到PCNA在實驗材料組和對照組的細胞中均有表達，與MTT增殖結(jié)果相符。結(jié)果表明，基于靜電紡絲技術的絲素蛋白支架具有良好的生物相容性。從仿生角度出發(fā)，通過對生物相容性良好的天然材料殼聚糖和膠原蛋白的靜電紡絲來從結(jié)構(gòu)和功能上仿生天然細胞外基質(zhì)。以六氟異丙醇三氟乙酸為共混溶劑，成功制備出了殼聚糖膠原蛋白復合支架。發(fā)現(xiàn)隨著混合體系中殼聚糖含量的增加，靜電紡納米纖維的直徑呈減小趨勢。選用戊二醛GA、水溶性碳二亞胺型縮合劑EDC、熱交聯(lián)以及紫外照射UVIRRADIATION交聯(lián)等方式對支架預處理，SEM照片顯示經(jīng)GA交聯(lián)后濕態(tài)條件殼聚糖膠原蛋白復合支架仍然保持纖維形態(tài)，交聯(lián)效果明顯，滿足了其保持納米纖維結(jié)構(gòu)以仿生組織細胞外基質(zhì)ECM的需要。生物相容性是生物材料研究中始終貫穿的主題，采用細胞培養(yǎng)法對殼聚糖膠原蛋白復合支架的生物相容性進行研究。HE染色后可清晰看到內(nèi)皮細胞在材料表面貼附牢固，外形飽滿，具有良好的生長狀態(tài)。SEM顯示細胞可進入三維網(wǎng)絡狀纖維內(nèi)部孔隙，呈現(xiàn)立體遷移生長。MTT法結(jié)果表明，殼聚糖膠原蛋白質(zhì)量比2080、5050材料組表現(xiàn)出較其它3組更好的細胞粘附與增殖能力。RTPCR檢測細胞ICAM1、PCNA以及P53基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)在管家基因Β2MICROGLOBULINB2M表達水平較一致的情況下，各個基因的表達水平是有差異的；就同一基因表達而言，殼聚糖膠原蛋白各組相互之間表達差異并不明顯，且與TCP相比亦無明顯差異。結(jié)果表明，基于靜電紡技術的殼聚糖膠原蛋白復合支架具有良好的生物相容性。

簡介：靜電紡絲技術是現(xiàn)階段一種制備數(shù)十到數(shù)百納米纖維的有效方法。由于生物高分子具有良好的生物相容性，近年來國內(nèi)外都對生物高分子的靜電紡絲做了大量的研究。靜電紡生物高分子在組織工程支架、組織修復等方面具有獨特的優(yōu)勢。本實驗通過靜電紡絲的方法制備明膠透明質(zhì)酸納米纖維膜，并通過SEM、FTIR、XRD、熱分析、接觸角、力學性能測試分析該納米纖維的各項物理、化學性能。實驗發(fā)現(xiàn)該復合纖維的直徑隨著透明質(zhì)酸在復合體系中的比例的增加而增大；在復合比例相同時，直徑隨著溶液總質(zhì)量體積比的遞增而逐漸增大。隨著透明質(zhì)酸的含量的增加，熱穩(wěn)定性下降，但親水性和力學性能均有所提高。為了提高靜電紡明膠透明質(zhì)酸纖維的耐水性和穩(wěn)定性，出于對生物毒性的考慮選用碳化二亞胺EDC作為交聯(lián)劑，并對交聯(lián)后的明膠透明質(zhì)酸納米纖維的性能進行了研究，實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過交聯(lián)的復合纖維，直徑較交聯(lián)前有所增大。交聯(lián)后纖維的脫水溫度、脫水過程的焓變、接觸角和應力都較交聯(lián)前有所提高。通過這些測試，我們對明膠透明質(zhì)酸復合纖維交聯(lián)前后的物理、化學性質(zhì)有了基本了解，為后續(xù)的細胞實驗和動物實驗奠定了基礎。通過在共混明膠透明質(zhì)酸納米纖維膜上種植成纖維、內(nèi)皮細胞，用MTT法檢測細胞的黏附與增殖情況，在體外評價材料的生物相容性。通過HE染色和SEM來檢測細胞在纖維膜上的生長形態(tài)。黏附實驗表明細胞在材料上能很好的黏附。增殖實驗表明細胞在各種比例的納米纖維材料上的增殖情況都要好于對照組玻片，隨著時間的增長，細胞的量明顯增多。HE染色和SEM結(jié)果顯示細胞在纖維膜上能保持良好的細胞形態(tài)。明膠透明質(zhì)酸納米纖維膜能為細胞提供良好的生長環(huán)境，未表現(xiàn)出細胞毒性。利用靜電紡明膠透明質(zhì)酸納米纖維膜作為皮膚敷料植入SD大鼠體內(nèi)，通過外表觀察和HE染色檢測纖維膜在動物體內(nèi)的生物相容性。實驗結(jié)果顯示，纖維膜植入SD大鼠體內(nèi)，和空白對照組具有相似的表面形態(tài)，同時均有巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生，一周以后都有大量的毛細血管產(chǎn)生，三周后上皮形成較完整。對傷口面積的測量顯示，兩周以后，植入纖維膜的傷口愈合面積更大。通過對明膠透明質(zhì)酸納米纖維的表征測試和生物相容性的評價說明明膠透明質(zhì)酸納米纖維可以作為良好的生物材料用于組織工程支架的構(gòu)建。

簡介：大連理工大學博士學位論文生物反應器內(nèi)成骨細胞的擴增和組織工程骨的構(gòu)建姓名宋克東申請學位級別博士專業(yè)化學工程指導教師劉天慶崔占峰20060501生物反應器內(nèi)成骨細胞的擴增和組織工程骨的構(gòu)建性能檢測，并對培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)代謝情況進行分析。結(jié)果顯示，在RWHMB內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞生長良好，分泌大量的細胞外基質(zhì)；中空纖維膜亦表現(xiàn)出良好的生物相容性。實驗結(jié)果證實RWHMB能結(jié)合RWVB和中空纖維膜的優(yōu)點，較好的模擬體內(nèi)環(huán)境，對所培養(yǎng)的細胞施加適當?shù)牧黧w應力刺激，促進細胞的新陳代謝和物質(zhì)交換，更有利于細胞的生長及增殖。利用擴增出的成骨細胞作為種子細胞，將其分別以2LO％ELLS／ML和1106CELLS／ML兩種密度接種到生物衍生骨支架材料上，在RWVB內(nèi)進行三維組織工程骨的構(gòu)建。對所構(gòu)建的骨組織分別進行倒置顯微鏡INVERTEDMICROSCOPE、掃描電鏡SEM、堿性磷酸酶舢LPL、礦化結(jié)構(gòu)和AO／EB雙重熒光染色等生物學性能檢測，并對培養(yǎng)過程的營養(yǎng)物質(zhì)代謝情況進行監(jiān)控和分析。結(jié)果顯示以這兩種密度接種在RWVB中培養(yǎng)的骨組織生長良好，能分泌大量膠原纖維，并有礦化基質(zhì)和新骨樣組織形成。通過RWVB內(nèi)部流體對流所產(chǎn)生的應力刺激，可提高成骨細胞堿性磷酸酶的活性表達，并加速礦化結(jié)節(jié)的形成，從而完成成骨細胞的快速增殖與分化以及工程化組織的三維構(gòu)建。為進一步探索骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的方法，用經(jīng)綠色熒光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP標記的新西蘭兔顱骨來源的成骨細胞復合到生物衍生骨支架材料上，在RWVB內(nèi)三維構(gòu)建組織工程骨，同時與靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中構(gòu)建的組織工程骨進行比較。每12小時取樣一次，分別進行乳酸、葡萄糖、PH的測定，一周后取出標本通過掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、組織學、免疫組織化學、流式細胞儀、細胞計數(shù)、染色體倍體分析等手段比較利用RWVB構(gòu)建的組織工程骨與靜態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建的組織工程骨的差異。結(jié)果顯示RWVB中以兩種密度接種和構(gòu)建的組織生長良好，細胞仍保持正常的細胞周期和染色體形態(tài)，并且RWVB中的構(gòu)建物的細胞擴增是靜態(tài)培養(yǎng)的5倍。研究結(jié)果進一步證實了骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的現(xiàn)實可行性。對三維構(gòu)建的組織工程骨修復新西蘭兔橈骨大段骨缺損進行了動物實驗研究。制作新西蘭兔橈骨中段15MM骨缺損實驗模型，隨機分為實驗組、對照組和空白組，實驗組植入經(jīng)RWVB構(gòu)建的組織工程骨、對照組植入靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中構(gòu)建的組織工程骨、空白組僅植入空白的生物衍生骨支架材料。術后對動物進行大體觀察、X攝線觀察各組不同時期骨缺損的修復情況，并于術后4周和8周取出骨缺損區(qū)分別進行大體觀察、組織學切片觀察和圖像分析新生骨的面積值。結(jié)果顯示術后8周實驗組的骨缺損幾乎完全修復，在三組中效果最好。空白組術后8周缺損區(qū)僅僅充滿纖維和結(jié)締組織。在RWVB構(gòu)建的生物衍生骨支架與成骨細胞的復合物具有很好的修復大段骨缺損的能力?？傊?，本研究確定了在RWVB和RWHMB中擴增骨組織工程種子細胞的最佳工藝和操作參數(shù)，明確了這兩種反應器都可以提供低剪切力的培養(yǎng)環(huán)境，而且細胞之間有三維聯(lián)系的機會，成骨細胞表現(xiàn)出良好的體外擴增能力，適于建立一種理想的成骨細胞體外擴增的三維培養(yǎng)體系，并且中空纖維膜可以作為一種改進的載體用于骨組織工程種子細

簡介：第四軍醫(yī)大學博士學位論文分類號密級國際十進分類號（UDC）第四軍醫(yī)大學學位論文人胎盤來源干細胞的生物學性狀檢測及人胎盤來源干細胞的生物學性狀檢測及用于構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究用于構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究（題名和副題名）劉大順劉大順（作者姓名）指導教師姓名指導教師姓名邱建華邱建華教授（主任醫(yī)師）教授（主任醫(yī)師）指導教師單位指導教師單位第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科申請學位級別申請學位級別博士博士專業(yè)名稱專業(yè)名稱耳鼻咽喉科學耳鼻咽喉科學論文提交日期論文提交日期200904答辯日期答辯日期200905論文起止時間論文起止時間2007年2月至月至2009年4月學位授予單位學位授予單位第四軍醫(yī)大學第四軍醫(yī)大學第四軍醫(yī)大學博士學位論文人胎盤來源干細胞的生物學性狀檢測人胎盤來源干細胞的生物學性狀檢測及用于構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究及用于構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究研究生劉大順研究生劉大順學科專業(yè)耳鼻咽喉科學學科專業(yè)耳鼻咽喉科學所在單位第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院耳鼻喉科所在單位第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院耳鼻喉科導師邱建華師邱建華教授（主任醫(yī)師）教授（主任醫(yī)師）關鍵詞關鍵詞人胎盤來源干細胞；組織工程；軟骨；分化；人胎盤來源干細胞；組織工程；軟骨；分化；中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學2009年05月

簡介：點擊查看更多生物工程用低彈性模量鈦合金組織與性能的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：本論文以基因工程菌PICHIAPASTIS高密度發(fā)酵獲得的重組人源膠原蛋白RECOMBINANTHUMANSOURCECOLLAGEN，RHSC為主要研究對象，對其進行分離純化和結(jié)構(gòu)表征，并與殼聚糖復合，通過冷凍干燥技術制備三維多孔狀海綿支架。選擇具有強抗氧化活性的原花青素PROANTHOCYANIDINS，PA作為交聯(lián)劑，以期提高支架的各方面特性。1通過分離純化獲得的RHSC達到電泳純，測試顯示純度＞99％，回收率＞93％。采用DSC，紫外光譜，紅外光譜和NMR對RHSC進行結(jié)構(gòu)表征，并與標準Ⅲ型膠原蛋白比對，確定RHSC具有Ⅲ型膠原蛋白的特征結(jié)構(gòu)。2通過改變殼聚糖重組人源膠原蛋白海綿基質(zhì)制備過程中的因素發(fā)現(xiàn)，醋酸的濃度和殼聚糖與RHSC的質(zhì)量比是影響微觀結(jié)構(gòu)形成的關鍵因素。通過PA交聯(lián)作用制備的海綿成品具有良好的理化性質(zhì)，其內(nèi)部孔徑約為110160ΜM，孔隙率＞92％，吸水率約為3900％紅外光譜測試發(fā)現(xiàn)，PA與海綿基質(zhì)可以形成穩(wěn)定的氫鍵DSC和TG分析顯示通過交聯(lián)作用，海綿的熱穩(wěn)定性提高體外酶解實驗表明，交聯(lián)后海綿的抗酶解能力增強。對海綿進行生物相容性研究，內(nèi)容包括細胞的黏附、遷移、增殖和細胞形態(tài)等方面，結(jié)果顯示海綿支架具有較好的細胞相容性。PA交聯(lián)的殼聚糖重組人源膠原蛋白海綿是一種理化性質(zhì)良好的生物材料，對細胞的黏附、生長和增殖都有一定的促進作用，盡管目前還處于實驗研究階段，但有望進一步應用于組織工程化器官的研究以及臨床的應用。

簡介：浙江大學碩士學位論文生物功能化梳狀聚乙二醇改性組織工程材料表面的研究姓名浦鳴申請學位級別碩士專業(yè)材料學指導教師計劍20060301浙江大學碩士學位論文向自由能低的表面遷移。細胞黏附率，增殖率，MTR活性以及掃描電鏡觀察的研究結(jié)果顯示，成骨細胞在2％的CPEG共混改性PLA材料上的細胞黏附和增殖有所改善，而含量為8％和15％的CPEG在自遷移過程中由于其體積排斥效應阻抗了細胞的黏附和增殖。關鍵詞組織工程梳狀NLN；表面自遷移；仿生；細胞相容性；血液相容性；原子轉(zhuǎn)移自由基聚合ATRPTI

簡介：點擊查看更多智能化組織工程組織仿生培育系統(tǒng)的研制及壓應力對組織工程骨中MSCs生物學作用的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：中山大學碩士學位論文可降解骨組織工程支架生物相容性及其復合RHBMP2后成骨效能的研究姓名李軼申請學位級別碩士專業(yè)口腔頜面外科指導教師冉煒20040520中山大學碩十學位論文可降解骨組織工程支架生物相容性駛北復合RHBMP．2后成骨效能的研究體標本、組織學觀察體內(nèi)異位成骨隋況。20只成年新西蘭兔雙側(cè)下頜骨下緣形成15MMX6MM全層骨質(zhì)缺損，然后將復合RHBMP一2的支架材料植入一側(cè)缺損，未復合RHBMP一2的支架材料植入另一側(cè)作為陰性對照。術后2周、4周、8周、L2周取材行大體標本、X片觀察、組織學觀察、電鏡觀察及計算機圖像分析。結(jié)果①新型骨組織工程支架A、B、C與對照材料D均系多IL支架材料，平均孔隙率80～85％，微孔直徑分布在200～3001JM，大孔附壁上有小孔，其問有相互貫通的微孔，表面粗糙O發(fā)現(xiàn)支架材料A、B、C與對照材料D相比，支架材料C生物相容性好，同期成骨量最大。支架材料A、B組出現(xiàn)明顯的異物肉芽腫反應。O復合RHBMP一2的支架材料C植入背部肌袋里2周后發(fā)現(xiàn)材料有少量降解并被纖維組織包繞、間充質(zhì)細胞聚集、炎癥反應輕微。4周后材料進一步降解并見類骨質(zhì)、軟骨組織以及纖細的骨小梁形成。8周見骨組織進一步成熟。對照組始終無骨組織形成；復合RHBMP一2的支架材料C修復缺損成骨時間早，成骨面積多，血管增生明顯，同期成骨量大。在缺損邊緣區(qū)可見新生骨從斷端向中央網(wǎng)孔內(nèi)生長，包括膜內(nèi)成骨、軟骨成骨和直接成骨；缺損中央?yún)^(qū)可見直接成骨呈多中心成骨。至12周時缺損基本修復。對照側(cè)未見多中心成骨現(xiàn)象，缺損未能完全修復。術后12周實驗組和對照組材料均有殘留。結(jié)論①支架材料C生物相容性好，成骨效果優(yōu)于對照材料D，是一種較為理想的骨組織工程生物支架材料。支架材料A、B不適宜作為骨組織工程生物支架材料；⑦支架材料C復合RHBMP一2后植入體內(nèi)有較強的異位成骨能力，是BMP的良好載體；O支架材料C在體內(nèi)具有傳導骨形成功能，復合RHB船2后有誘導一傳導雙重功能，是一種很有前途的骨組織支架材料。但是由于其本身的生物力學及降解速度方面的缺陷，使其應用受到限制，故需要更深入的研究。關鍵詞骨組織工程支架；頜骨缺損；異位成骨；骨形成蛋白；兔；

簡介：人機工程仿真分析能夠在設計早期對產(chǎn)品的人機因素進行分析和評價，利用計算機建立人體和機器的計算模型，融入人體生理特征，模擬人操作機器的各種動作，進而將人、機相互作用的動態(tài)過程可視化，通過結(jié)合人機工程學的各種評價標準和算法，對產(chǎn)品機的人機因素進行量化分析和評價。人機工程仿真分析一方面可以大大降低產(chǎn)品開發(fā)的成本，為產(chǎn)品創(chuàng)新提供強有力的支持；另一方面，可以大大降低一些危險性產(chǎn)品的測試風險。虛擬人體模型是人機工程仿真分析的核心，它作為真實人體的替身，是檢驗和分析產(chǎn)品設計方案中人機工程性能的關鍵?，F(xiàn)有人體模型在人體數(shù)據(jù)支持，模型精度以及功能應用等方面都存在很多缺陷，使其無法滿足越來越高級、復雜的人機工程分析、評價算法的需要。論文以人機工程仿真設計、分析、評價為目的，建立了由幾何模型、運動模型、內(nèi)力模型和外力模型四部分組成的虛擬人體生物力學模型，并圍繞上述需求展開相關理論、技術和方法的研究工作。論文首先討論了面向人機工程仿真的人體幾何模型的建模方法，從人體解剖學出發(fā)，通過對人體的動、靜態(tài)測量數(shù)據(jù)進行參數(shù)化，以及對關節(jié)運動約束機制的改進，使模型具有更詳盡的人體數(shù)據(jù)咨詢能力；為了更好地支持肌肉的生物力學分析，探討了骨骼肌的幾何建模方法。針對人機交互過程中上述幾何模型的運動建模問題，論文給出了兩種互補的方法。一種方法是對傳統(tǒng)的基于逆向運動學的改進，以快速、有效地調(diào)整人體姿勢為目的，給出了基于人體生理約束的IK算法及基于時空約束的IK改進算法；另一種方法以運動捕獲技術為基礎，針對簡單骨骼到復雜骨骼的運動重定向情況，提出了新概念及新方法來處理重定向過程中產(chǎn)生的關節(jié)冗余問題。從而達到精確地再現(xiàn)人體動作，保證人機分析的準確性的目的。為了對骨及關節(jié)的受力情況進行人機分析，論文建立了針對人體各環(huán)節(jié)的骨及關節(jié)的外力和扭矩的求解模型，亦稱為外力模型。以多剛體簡化模型和人體生物力學參數(shù)為建?；A，以逆向動力學及多剛體系統(tǒng)動力學為理論依據(jù)，針對動、靜態(tài)兩種情況，分別給出了基于生物力學的外力求解模型。以實現(xiàn)肌肉施力分析為目的，論文討論了肌肉在動、靜性收縮兩種情況下，人體表面骨骼肌的肌肉力預測模型，文中亦稱為內(nèi)力模型。根據(jù)大腦控制肌肉的最優(yōu)化原則，采用有約束最優(yōu)化方法，對靜性收縮情況，分別建立人體系統(tǒng)的平衡約束方程和肌肉的約束方程，并將其作為約束條件進行優(yōu)化求解；對動性收縮情況，則由偽速度形式的拉格朗日動力學方程推導出等式約束方程以及應用HILL三元素模型推導出不等約束方程。通過對約束方程的改進，進一步提高了該模型的精度。最后，開發(fā)了一個面向人機工程仿真分析的原型系統(tǒng)ZJUERGOMAN，作為對本文核心內(nèi)容及算法的驗證平臺。在第七章中，結(jié)合筆記本電腦桌的設計實例進一步驗證了本文模型的有效性。

簡介：人骨是一種結(jié)締組織，主要是由生物磷灰石和骨膠原纖維構(gòu)成。其中羥基磷灰石（HA）是人體硬組織，如骨骼和牙齒的主要無機成分，它為硬組織提供很好的剛性；骨膠原纖維是一種天然高分子，它賦予骨良好的柔韌性和優(yōu)異的生物活性。從材料學角度而言，大自然把有機物與無機物互相巧妙而緊密地結(jié)合起來形成骨，滿足了骨的生物學和力學要求。多年來，人們一直試圖通過將無機非金屬材料和有機高分子材料復合，制備多級結(jié)構(gòu)納米材料來模仿天然骨。人工合成的HA成分和結(jié)構(gòu)與骨相似，具有優(yōu)良的生物相容性和骨傳導，廣泛應用于骨科。左旋聚乳酸（PLLA）作為一種性能優(yōu)異的可降解高分子材料，已被美國食品藥品管理局（FDA）許可應用于臨床，在藥物控釋和組織修復方面具有廣闊的應用前景。將納米HA（NHA）與可降解的PLLA復合可以將HA的成骨性能與PLLA的生物相容性結(jié)合，獲得性能優(yōu)異的復合材料。但還存在諸如HA納米顆粒分散性不好，HA與PLLA界面相容性差，易相分離，植入體內(nèi)后骨結(jié)合能力不理想等問題，已經(jīng)成為制約其最終應用的一個關鍵因素。NHAPLLA復合材料的制備方法還有很大的研究空間，通過對實驗數(shù)據(jù)進行可靠的統(tǒng)計分析，有助于研制具有更好的力學性能、生物相容性和成骨性的復合材料。本文從HA納米粒子表面改性出發(fā)，設計并制備了改性NHAPLLA組織工程支架，并通過體內(nèi)、體外實驗對材料的性能進行了研究，主要內(nèi)容如下采用表面接枝聚（Γ芐基L谷氨酸）（PBLG）的改性NHA（PBLGGHA）與PLLA復合，獲得新型HAGPBLGPLLA納米復合材料。通過對HA表面化學改性，有效改善了NHA在氯仿溶液中的均勻分散性，實現(xiàn)了HA表面從親水性到疏水性的轉(zhuǎn)變，進而可以增強HA與PLLA基體的相互作用。采用相分離技術制備了具有三維多孔結(jié)構(gòu)的組織工程支架，其孔隙率在85％以上，孔徑在30200ΜM，具有大孔小孔共存的多級結(jié)構(gòu)。通過觀察骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCS）形態(tài)及其細胞增殖狀況，對成骨細胞在支架表面的粘附、生長和增殖的情況進行探究；通過實時定量熒光PCR（RTPCR）實驗技術檢測成骨相關基因的表達；通過對鼠顱骨和股骨缺損進行體內(nèi)修復實驗，考察材料的骨修復效果及其臨床應用潛能。研究結(jié)果表明，PBLGGHAPLLA復合材料由于加入了NHA，其細胞粘附、生長、增殖和以及I型膠原（COLI）等成骨相關基因的表達明顯上調(diào)；三維支架材料的生物學性能和動物骨骼修復效果明顯優(yōu)于HAPLLA復合材料和PLLA高分子材料；體外實驗顯示當PBLGGHA在復合材料中比重為10時，體外誘導BMSCS成骨向分化的能力最強；體內(nèi)實驗ΜCT、HE染色和I型膠原蛋白（COLI）免疫組化結(jié)果顯示，PBLGGHAPLLA組織工程支架的骨生成性能明顯增高；利用TRAP染色評價不同支架對于破骨細胞數(shù)及染色濃度的影響，觀察到處理組間染色濃度和破骨細胞數(shù)沒有顯著差別，而空白對照組表面的破骨細胞數(shù)量更多。與文獻相比，在HA表面改性方面的文獻多數(shù)集中于改善其浸潤性，而對改性HA的生物性能卻較少關注。本文的主要創(chuàng)新在于材料結(jié)構(gòu)設計方面在充分考慮到界面物理性能的同時，又兼顧了材料的生物性能的提高，同時實現(xiàn)了物理性能和生物性能的改善；此外，本文所采用的改性方法在室溫即可完成，同時適用于多種氨基酸單體的聚合及材料表面改性的處理，具有很好的普適性。另外，本文深入研究了PBLGGHAPLLA納米復合材料的生物相容性、成骨活性，為新材料的制備和臨床應用提供了實驗依據(jù)，同時證明PBLGGHAPLLA支架具有良好的成骨性，有望作為一種新的骨組織修復材料在臨床中取得應用。

簡介：當前臨床上出現(xiàn)了大量針對傳統(tǒng)抗生素的耐藥細菌株和一些強致病性病毒毒株，人類健康常常受到病原微生物的威脅。面對感染防治的嚴峻形勢，我們不得不努力尋找新型的抗感染物質(zhì)。經(jīng)過近二十年的研究，發(fā)現(xiàn)在植物、昆蟲和包括人在內(nèi)的高等動物機體內(nèi)存在近千種內(nèi)源性陽離子肽防御素DEFENSIN。具有活性的防御素分子一般為3～6KD，多數(shù)分子內(nèi)存在6～8個保守半胱氨酸殘基形成的3～4對鏈內(nèi)二硫鍵外，還富含精氨酸、脯氨酸等特殊殘基，整個分子在中性溶液中帶正電荷；晶體衍射揭示防御素分子具有Α螺旋、Β折疊、二硫鍵橋、無規(guī)卷曲等單種或多種二級結(jié)構(gòu)所形成的單體或多聚體空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)二硫鍵等結(jié)構(gòu)的組成方式，防御素被分為Α、Β和Θ等類型。研究已證實，有805種防御素不僅具有快速、強效地殺滅多種細菌的活性，并且還具有不誘導產(chǎn)生耐藥菌株的特性；有261種防御素具有抗白色念珠菌等真菌和螺旋體的作用；有48種防御素具有抗HIV、HPV和或HSV等病毒的效果；有54種防御素可產(chǎn)生抗癌細胞的生物效應。此外，防御素作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與了免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能。因此，防御素成為當前研究的熱點領域之一。生物學家們認為防御素可能成為一種新型的抗生素，在作為抗感染制劑、食品防腐劑等方面具有廣闊的應用前景。國外有數(shù)家制藥公司在進行防御素的開發(fā)研究，但因防御素分子太小、含特殊氨基酸較多及具有的抗微生物活性等原因，目前制約防御素產(chǎn)品走上市場的主要瓶頸依然是尚未建立成本低廉、高效穩(wěn)定的制備工藝。人Α防御素5是由小腸潘氏細胞、泌尿生殖道粘膜等上皮細胞中表達的一種生物活性肽。通過對組織提取和化學合成肽的活性檢測發(fā)現(xiàn)人Α防御素5既可以高效殺滅多種細菌，又具有抗病毒的生物活性?；谌甩》烙?在小腸隱窩上皮細胞中組成性或誘導性高表達的特點和腸道是人體最大內(nèi)源性感染病原菌貯存庫的關聯(lián)性，我們認為Α防御素5是感染防治研究的重要靶分子。因人Α防御素5的組織提取和化學合成存在產(chǎn)量低、成本高等問題，所以基因工程制備應該是獲得大量活性肽的理想途徑。鑒于缺乏制備重組防御素相關工藝報道的現(xiàn)狀，為滿足腸道損傷修復與抗感染等研究的需求，本課題率先探索了人Α防御素5的生物工程制備過程及重組產(chǎn)品的生物活性?，F(xiàn)將研究中所采用的主要方法、獲得的主要結(jié)果和結(jié)論簡述如下1DEFA5基因的克隆與生物信息學分析采用RTPRC技術，從經(jīng)LPS誘導表達的LOVO細胞總RNA中克隆出DEFA5的閱讀框序列，并構(gòu)建PUCMTDEFA5重組載體。利用DNASTAR、ANTHEPROT50等生物學軟件與信息平臺分析了DEFA5的信號肽、生化性質(zhì)等特點，篩選出生物活性可能最強的MHD5序列。2重組原核表達載體及其表達工程菌株的構(gòu)建基于第一章所獲得的MHD5序列和有關DEFA5的信息，模擬DEFA5信號肽與前片段的性質(zhì)，篩選并克隆用于融合表達的承載分子MTRXA、TRXA和MALE的序列及其表達載體；同時，根據(jù)表達載體的特點設計特異引物，擴增出帶有不同克隆位點的MHD5片段，分別構(gòu)建了PQEMHD5、PQEMTRXAMHD5、PETMHD5和PMALMHD5表達載體及PQEMHD5M15、PQEMTRXAMHD5M15、PETMHD5ROSETTAGAMIB和PMALMHD5BL21等工程菌株。3融合蛋白和RMHD5的表達、純化與活性檢測經(jīng)IPTG誘導和表達條件的優(yōu)化，獲得了MTRXAMHD5包涵體蛋白MW17135724DA和TRXAMHD5MW20646552DA、MALEMHD5MW48602468DA2種可溶性融合蛋白的高效表達，表達量占菌體總蛋白的比例分別為40％、269％和267％，融合蛋白中目的肽所占百分比分別為212％、174％和74％。分別采用親和層析、離子交換層析等不同策略對3種融合蛋白進行純化、裂解與鑒定。從MALEMHD5酶解體系中分離純化獲得267MG重組目的肽，并證實對大腸桿菌標準株ATCC25922和金黃色葡萄球菌標準株ATCC25923均具有抗菌活性。4酵母表達載體的構(gòu)建利用LETO軟件優(yōu)化出酵母細胞偏好的MHD5密碼子，并設計合成1對長鏈引物，采用重疊延伸PCR方法擴增MHD5優(yōu)化序列DNA。成功構(gòu)建含有MHD5天然序列和優(yōu)化序列的酵母表達載體PPIC9KNMHD5和PPIC9KOMHD5。5高拷貝轉(zhuǎn)化酵母克隆的篩選與發(fā)酵工藝的建立選用SACⅠ限制性內(nèi)切酶線型化重組表達質(zhì)粒，利用載體與GS115酵母菌株基因組在5’AOX區(qū)進行單交換同源重組可產(chǎn)生多拷貝外源基因整合的原理，采用電擊轉(zhuǎn)化、篩選和再次電擊轉(zhuǎn)化的方法，將多拷貝目的基因整合到酵母細胞基因組中。通過PCR鑒定、G418抗性篩選和表型鑒定，分別獲得了可耐受8MGMLG418，表型為HISMUT的5株PPIC9KOMHD5GS115高拷貝轉(zhuǎn)化克隆005007008009010和3株PPIC9KNMHD5GS115高拷貝轉(zhuǎn)化克隆N06、N08、N09。挑選O05、O08、O09、N06、N08和N096株克隆在搖瓶中進行甲醇誘導發(fā)酵，采用RTPCR技術鑒定所挑選的6株克隆均能在MRNA水平上成功表達目的肽的基礎上，采用WESTERNBLOT分別對其中的4個克隆株O05、O09、N06、N08進行了蛋白水平的表達鑒定，結(jié)果顯示密碼子經(jīng)優(yōu)化的MHD5表達量獲得了顯著性提高。篩選出表達量最高的克隆O09進行發(fā)酵罐高密度發(fā)酵實驗。經(jīng)過2次發(fā)酵罐發(fā)酵過程的探索，綜合采用DO值監(jiān)測、酵母細胞生長活力檢測和目的蛋白表達的檢測等措施，建立PPIC9KOMHD5GS115種子工程菌的發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，并取得不同時間段中DO值、PH值、空氣氧化傳送速率、甘油甲醇流加速率等參數(shù)的優(yōu)化值。獲得重組目的肽含量約10％的表達上清39L。6重組肽的純化與鑒定采用反相層析、親和層析、離子交換層析和分子篩層析等分離方法，建立起重組肽回收率較高的純化工藝發(fā)酵上清→NI柱親和層析→陽離子交換層析→濃縮脫鹽層析→凍干。共獲得純化重組肽1529871MG，產(chǎn)品得率為392275MGL發(fā)酵上清。產(chǎn)品經(jīng)HPLC分析，純度為8173％，經(jīng)SDSPAG、WESTERNBLOT和質(zhì)譜鑒定證實產(chǎn)品成分是重組人Α防御素5成熟肽。7生物活性檢測與作用機制探討①抗菌活性檢測應用平板法檢測了重組肽的抗菌活性，結(jié)果表明重組產(chǎn)品對3種標準菌株ATCC25922、ATCC25923和ATCC27853均具有較強的殺滅活性。采用稀釋法測定了重組肽對14種菌株包括3種標準菌株和13種臨床分離菌株的MIC，結(jié)果顯示產(chǎn)品具有很強的殺滅G菌活性，對G菌的作用稍弱。②抗菌機制初探應用掃描電鏡和透射電鏡觀察了ATCC25922和ATCC259232種菌株與重組肽作用前后的形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)了重組人Α防御素5成熟肽引起G菌細胞外膜脂質(zhì)突起，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊，進而導致菌體腫脹、破碎的現(xiàn)象；而G菌細胞膜結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)有明顯改變。結(jié)果顯示，人Α防御素5是通過“地毯機制”作用模型發(fā)揮的抗菌活性。③抗病毒活性檢測首先采用MTT法檢測了重組產(chǎn)品對HELA細胞增殖的影響，結(jié)果表明在100UGML以下濃度，重組肽對細胞無毒性作用。通過基因轉(zhuǎn)染和病毒擴增與濃縮、純化，成功制備基因組中含熒光蛋白閱讀框的重組HPV5含紅色熒光蛋白基因和HPV16含綠色熒光蛋白基因病毒液，測得后者的感染性滴度為51010。以HELA細胞為靶細胞進行重組肽抑制HPV感染的實驗，經(jīng)熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀分析表明重組肽對HPV具有很強的抑制活性，且活性與濃度呈依賴關系，當重組肽濃度達667UGML時，抑制率達90％以上?？共《净钚缘臅r間效應關系實驗表明，人Α防御素5抗HPV的活性發(fā)生在病毒感染細胞的早期過程，作用機制可能包括防御素作用于細胞后提高了靶細胞的抗病毒能力?？傊?，本課題完成了人Α防御素5的開發(fā)性研究，建立了從基因克隆、載體及其表達系統(tǒng)的選擇與構(gòu)建、表達種子工程菌的篩選、發(fā)酵表達條件的優(yōu)化與放大，直至產(chǎn)物的分離純化、生物活性測定等整套工藝。為大量制備具有生物活性的人Α防御素5及其它類似多肽搭建了平臺，促進了防御素臨床前研究的進程，并為其走向臨床應用打下了基礎。