簡(jiǎn)介：目的檢測(cè)濟(jì)南地區(qū)無償獻(xiàn)血者血漿中乙型肝炎病毒表面抗原HBSAG、抗丙型肝炎病毒HCV抗體、抗人類免疫缺陷病毒HIV抗體以及抗人皰疹病毒8型HHV8IGG抗體，分析我國(guó)濟(jì)南地區(qū)獻(xiàn)血人群中相關(guān)病毒的感染情況和流行病學(xué)特點(diǎn)；為濟(jì)南地區(qū)無償獻(xiàn)血人群的選擇和制定招募安全血源的策略提供理論依據(jù)。方法1血清學(xué)檢測(cè)11利用ELISA方法對(duì)2006年1月～2006年12月無償獻(xiàn)血者的血漿標(biāo)本43904份進(jìn)行HBSAG、抗HCV、抗HIV的檢測(cè)；抗HIV檢測(cè)呈陽性者送山東省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行WESTERNBLOT確認(rèn)。12利用ELISA方法對(duì)其中520份獻(xiàn)血者血漿進(jìn)行抗HHV8IGG抗體的檢測(cè)，包被抗原為HHV8結(jié)構(gòu)蛋白FK81合成多肽。2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理2006年1月～2006年12月的獻(xiàn)血者基本資料和各項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果應(yīng)用SPSS100統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用X2檢驗(yàn)。結(jié)果143904份獻(xiàn)血者血漿中HBSAG檢出率為204％89843904，抗HCV檢出率為078％34443904，抗HIV檢出率為00045％243904。520份獻(xiàn)血者血漿中抗HHV8檢出率為5962％31520。2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，HBSAG、抗HCV檢出率在不同年齡組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005，在不同職業(yè)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005；男性獻(xiàn)血者中HBSAG的檢出率高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義JP005。結(jié)論濟(jì)南市無償獻(xiàn)血者中存在一定比率的HCV感染者及相對(duì)較高的HBV、HHV8感染者，同時(shí)尚存在個(gè)別HIV感染者。在以后的血液篩查工作中有必要進(jìn)一步提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度以及加強(qiáng)招募前的篩查工作，以不斷提高輸血安全。

簡(jiǎn)介：目的建立羊椎間盤退變模型；應(yīng)用腺相關(guān)病毒ADENOASSOCIATEDVIRUS，AAV介導(dǎo)人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子ΒHUMANTRANSFMINGGROWTHFACTΒ，HTGFΒ和人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子HUMANVULARENDOTHELIALGROWTHFACT，HVEGF基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染羊退變椎間盤，觀察AAVHTGFΒ和HVEGF的表達(dá)以及單基因轉(zhuǎn)染和雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)退變椎間盤的生物學(xué)作用。方法成年SPFSPECIFICPATHOGENFLEE，SPF級(jí)去勢(shì)山羊，通過11號(hào)刀片損傷椎間盤前外側(cè)纖維環(huán)的方法建立椎間盤退變模型，造模后4、8、12、24周分別進(jìn)行影像學(xué)和組織學(xué)檢測(cè)，觀察造模椎間盤變化。將造模成功動(dòng)物隨機(jī)分為A、B、C、D和E5組，各組分別于造模椎間盤內(nèi)注射50ΜL試劑A組RAAV2HTGFΒ、B組RAAV2HVEGF、C組RAAV2HTGFΒRAAV2HVEGF、D組磷酸鹽緩沖液PBS、E組RAAV2EGFPENHANCEDGREENFLUESCENTPROTEIN，EGFP。轉(zhuǎn)染后2、4、8、12周時(shí)分別進(jìn)行影像學(xué)、組織學(xué)和生物化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果1影像學(xué)和組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明造模動(dòng)物椎間盤發(fā)生緩慢、可靠的退行性變。2基因轉(zhuǎn)染后椎間盤的變化①影像學(xué)檢測(cè)A組、C組動(dòng)物椎問盤高度指數(shù)DISCHEIGHTINDEX，DHI均高于D組，C組更顯著，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組與D組無顯著性差異。②組織學(xué)檢測(cè)HE、SAFRANINE0染色后觀察到A組、C組動(dòng)物椎間盤細(xì)胞數(shù)目減少量、結(jié)構(gòu)紊亂程度、髓核纖維環(huán)界限模糊程度等均低于D組。B組與D組無顯著性差異。免疫組化染色后觀察到A組、C組動(dòng)物椎間盤髓核中Ⅱ膠原含量下降程度、纖維環(huán)中Ⅰ膠原含量下降程度均低于D組，C組更顯著，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組與D組無顯著性差異；轉(zhuǎn)染兩周后，A組、B組和C組的RAAV2HTGFΒ、RAAV2HVEGF和RAAV2HTGFΒRAAV2HVEGF較D組顯著增多；E組動(dòng)物轉(zhuǎn)染后12周仍可觀察到EGFP的表達(dá)。③生物化學(xué)檢測(cè)A組、C組動(dòng)物椎間盤Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的含量下降程度均低于D組，C組更顯著，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組與D組無顯著性差異。結(jié)論1本方法可以成功建立一種椎間盤退變動(dòng)物模型；2RAAV2HTGFΒ和RAAV2HVEGF轉(zhuǎn)染退變的椎間盤后，可持續(xù)表達(dá)12周；3HTGFΒ轉(zhuǎn)染可在一定程度上逆轉(zhuǎn)椎間盤退變；4HVEGF可協(xié)同HTGFΒ逆轉(zhuǎn)椎間盤退變；5HTGFΒ和HVEGF共轉(zhuǎn)染具有協(xié)同效應(yīng)。

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建骨形成蛋白7BMP7腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒PAAVHBMP7IRESZSGREEN和SOX9腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒PAAVHSOX9IRESTDTOMATO并進(jìn)行腺相關(guān)病毒包裝體外共同轉(zhuǎn)染人椎間盤細(xì)胞評(píng)價(jià)其生物學(xué)效應(yīng)。方法用分子克隆技術(shù)從質(zhì)粒PUC57HBMP7獲得BMP7CDNA并克隆至AAV包裝質(zhì)粒PAAVIRESZSGREEN上構(gòu)建成PAAVHBMP7IRESZSGREEN的AAV重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后由深圳百恩維公司對(duì)PAAVHBMP7IRESZSGREEN進(jìn)行包裝同法獲得SOX9過表達(dá)腺相關(guān)病毒PAAVHSOX9IRESTDTOMATO的包裝AAVBMP7與AAVSOX9聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變的椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞WESTERNBLOTTING檢測(cè)BMP7與SOX9蛋白表達(dá)以及髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)量的變化。結(jié)果經(jīng)酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)AAV包裝質(zhì)粒PAAVHBMP7IRESZSGREEN與PAAVHSOX9IRESTDTOMATO構(gòu)建完成熒光免疫組化顯示BMP7與SOX9蛋白表達(dá)百思維公司包裝出具有生物學(xué)功能的AAVBMP7AAVSOX9構(gòu)建成功。WESTERNBLOTTING顯示BMP7與SOX9在纖維環(huán)細(xì)胞中表達(dá)AAVBMP7與AAVSOX9雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染的纖維環(huán)細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)量明顯較AAVBMP7與AAVSOX9基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)量多。結(jié)論構(gòu)建AAVBMP7和AAVSOX9可在體外表達(dá)BMP7在體外能夠協(xié)同SOX9促進(jìn)退變纖維環(huán)細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)增加為BMP7與SOX9體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與基因逆轉(zhuǎn)椎間盤的早期退變提供了理論依據(jù)。

簡(jiǎn)介：目的了解遵義市兩城區(qū)（紅花崗區(qū)及匯川區(qū)）乙型肝炎病毒的感染情況及乙型肝炎后肝硬化的發(fā)病情況，分析乙型肝炎病毒感染者及乙型肝炎后肝硬化病人的性別及年齡差異，探討性別及年齡因素對(duì)乙型肝炎病毒感染及乙型肝炎后肝硬化發(fā)病的影響。方法收集2007年1月2009年12月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院病人（除外肝臟疾?。┑难獦?，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行乙肝病毒（HBV）血清學(xué)檢測(cè)，包括乙肝病毒表面抗原（HBSAG）、乙肝病毒表面抗體（HBSAB）、乙肝病毒E抗原（HBEAG）、乙肝病毒E抗體（HBEAB）、乙肝病毒核心抗體（HBCAB）；回顧性調(diào)查2007年1月2009年12月遵義市兩城區(qū)診斷為乙型肝炎后肝硬化的病人。被檢查人群按10歲一個(gè)年齡階段分為8個(gè)年齡組。結(jié)果被檢查人群中總的HBSAG陽性率為1263％，其中男性HBSAG陽性率為1762％，女性為823％，兩者之間有顯著差異（P001）；從10歲到60歲的各年齡組HBSAG的陽性率存在明顯的性別差異，男性HBSAG的陽性率明顯高于女性（P001），尤其是在2040歲年齡階段性別差異較明顯。遵義兩城區(qū)2007年1月2009年12月共有778例病人診斷為乙型肝炎后肝硬化，乙型肝炎后肝硬化總的發(fā)病率為837410萬人，其中男性發(fā)病率1194910萬人，女性發(fā)病率為458010萬人，男女發(fā)病率之比為2801。乙肝后肝硬化的發(fā)病率隨著年齡增加而增加，主要分布在4070歲，在20歲以上的各年齡組乙型肝炎后肝硬化的發(fā)病率存在明顯的性別差異，男性發(fā)病率明顯高于女性（P001），尤其在2050歲年齡階段性別差異較明顯。年齡、性別與乙肝病毒感染率及乙肝后肝硬化發(fā)病率存在相關(guān)性，經(jīng)多因素LOGISTIC回歸分析，年齡、性別為乙肝病毒感染及乙肝后肝硬化發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論乙型肝炎病毒感染率、乙肝后肝硬化在年齡及性別分布存在顯著差異，女性的乙肝病毒感染率及乙型肝炎后肝硬化的發(fā)病率明顯低于男性。

簡(jiǎn)介：背景人類腸道病毒HEV隸屬于小核糖核酸（RIBONUCLEICACIDRNA）病毒目（PICNAVIRALES）小RNA病毒科（PICNAVIRIDAE）腸道病毒屬（ENTEROVIRUS），基因組為單股正鏈RNA。病毒基因組的5非編碼區(qū)含有基因組RNA復(fù)制和翻譯所需的結(jié)構(gòu)，3非編碼區(qū)具有與基因組復(fù)制有關(guān)的高度保守的二級(jí)機(jī)構(gòu)及多聚腺苷酸POLYA尾。編碼區(qū)分為結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)P1和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)P2和P3。結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)P1依次編碼VP4、VP2、VP3和VP1共4個(gè)衣殼結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1蛋白位于病毒顆粒最外側(cè)，含有主要的抗原位點(diǎn)，是進(jìn)行基因分型和分子流行病學(xué)研究最主要的靶基因。根據(jù)VP1序列核苷酸差異，HEV分為HEVA組（HEVA）、B組HEVB、C組HEVC和D組HEVD4個(gè)組。目前，HEVB包含59個(gè)血清型，為4個(gè)組中所含血清型最多的一組。HEVB病毒不僅血清型別眾多，而且流行范圍廣泛，可導(dǎo)致多種疾病的暴發(fā)流行，加之HEV基因組變異迅速，新的血清型不斷出現(xiàn)，因而HEVB血清型病毒成為當(dāng)前研究關(guān)注的熱點(diǎn)之一。早在50多年前，人們就發(fā)現(xiàn)RNA病毒間復(fù)雜的基因變異。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，在全球多個(gè)脊髓灰質(zhì)炎（以下簡(jiǎn)稱脊灰）病毒PV減毒活疫苗免疫覆蓋率低的地區(qū)，多次出現(xiàn)由重組后的脊灰疫苗衍生株病毒循環(huán)CVDPVS導(dǎo)致的脊灰暴發(fā)，使消滅脊灰的免疫策略及疾病監(jiān)測(cè)變得更為復(fù)雜，也引起人們對(duì)HEV遺傳變異機(jī)制的研究產(chǎn)生了新的興趣，更加關(guān)注HEV基因組的易變性，為研究HEV的進(jìn)化提供了新的視點(diǎn)。HEV基因組的進(jìn)化方式包括核苷酸點(diǎn)突變和遺傳重組。P1編碼區(qū)的進(jìn)化幾乎均由核苷酸替換所引起的點(diǎn)突變驅(qū)動(dòng)的。P2和P3區(qū)編碼病毒復(fù)制所需的非結(jié)構(gòu)蛋白和酶，這些多肽蛋白序列的相對(duì)保守，功能相對(duì)穩(wěn)定，而大多數(shù)點(diǎn)突變對(duì)于蛋白和酶的功能來說是不利的，基因重組成為其進(jìn)化的主要手段。HEV的進(jìn)化就是基因組的各個(gè)部分在以不同方式進(jìn)化的同時(shí)，通過遺傳重組而產(chǎn)生出的被自然選擇的優(yōu)勢(shì)毒株的過程。由于3D編碼區(qū)位于基因組的3末端，故比較VP1和3D基因在系統(tǒng)發(fā)生上的差異，可作為篩選重組發(fā)生的指標(biāo)。在過去20多年里，山東省從急性弛緩性麻痹AFP、無菌性腦膜炎AM2種疾病監(jiān)測(cè)病例分離到上千株HEV山東株，其中多數(shù)屬于HEVB，且有些HEVB血清型呈現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)血清型。HEV感染已成為嚴(yán)重威脅廣大人群特別是兒童身體健康與生命安全的重大公共衛(wèi)生問題之一。因此，運(yùn)用分子流行病學(xué)的方法，通過對(duì)HEVB優(yōu)勢(shì)血清型山東株基因序列的分析，探索HEVB在區(qū)域性引入和擴(kuò)散過程中VP1進(jìn)化遺傳學(xué)和居群動(dòng)力學(xué)特征，分析不同血清型間重組在HEV進(jìn)化中的發(fā)生頻率，對(duì)于HEV所致相關(guān)疾病的機(jī)制及其預(yù)防控制均具有重要的理論和實(shí)際意義。研究目的1構(gòu)建并完善HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型CVA9、CVB3、CVB5、ECHO6、ECHO7、ECHO11、ECHO14、ECHO19、ECHO25、ECHO30的VP1區(qū)和3D區(qū)基因數(shù)據(jù)庫，并對(duì)其進(jìn)行基因特征研究。2探討HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型基因重組的發(fā)生，闡明各主要血清型在山東省共循環(huán)過程中的基因重組規(guī)律及重組基因片段的轉(zhuǎn)移方向和頻率。3分析HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型的基因序列起源、進(jìn)化速度及流行史重構(gòu)等進(jìn)化起源特征。研究方法1毒株來源本研究所選毒株來自山東省1989～2010年AFP和AM2種疾病監(jiān)測(cè)病例。實(shí)驗(yàn)前接種RD或HEP2細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖。2基因測(cè)序提取病毒RNA，RTPCR擴(kuò)增VP1和3D區(qū)基因片段，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后對(duì)陽性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。3型別鑒定將各血清型的VP1序列通過NCBI在線提供的BLAST程序與數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)，確定HEV山東株的血清型別。4生物信息學(xué)分析使用MEGA40軟件，構(gòu)建VP1區(qū)和3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析HEV山東株優(yōu)勢(shì)血清型基因重組情況。通過BEAST162軟件分析HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型的進(jìn)化遺傳學(xué)特征，重構(gòu)優(yōu)勢(shì)血清型毒株在山東省內(nèi)的流行史。主要結(jié)果1HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型的確定在前期研究中，已通過HEV分子生物學(xué)定型方法對(duì)部分山東株的血清型別進(jìn)行鑒定。本研究在前期研究基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)1989～2010年分離自山東省AFP和AM監(jiān)測(cè)病例的HEV山東株進(jìn)行型別鑒定，共鑒別出非脊灰腸道病毒NPEV1010株，涵蓋58個(gè)HEV血清型別。其中，CVA9、CVB3、CVB5、ECHO6、ECHO7、ECHO11、ECHO14、ECHO19、ECHO25、ECHO30這10個(gè)血清型在山東省歷年HEV檢測(cè)中共分離到792株，占所有已定血清型分離株的784％7921010，為HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型別。2HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型基因重組分析本研究共選取458株HEVB山東株3D序列進(jìn)行序列分析。通過構(gòu)建3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，山東省10個(gè)優(yōu)勢(shì)血清型毒株間在非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)內(nèi)存在頻繁的基因重組現(xiàn)象，山東株在3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹中共劃分為13個(gè)主要的基因簇。13D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，每個(gè)基因簇所包含血清型別不盡相同，同一血清型的山東株在3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹中分處不同的基因簇。每個(gè)基因簇的山東分離株歸屬于2～9個(gè)HEV血清型，第1、4、6、8、12、13基因簇為優(yōu)勢(shì)基因簇。23D編碼區(qū)不同基因簇的主要分離時(shí)間不完全相同。3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹基因簇的最長(zhǎng)分離時(shí)間跨度為21年，各基因簇平均優(yōu)勢(shì)分離時(shí)間跨度約為15（148±46）年。3HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型進(jìn)化起源分析本研究所選10個(gè)HEVB山東優(yōu)勢(shì)血清型毒株的祖先約起源于1885～1913年之間，不同血清型VP1區(qū)核苷酸序列每年每個(gè)堿基位點(diǎn)的進(jìn)化速度為1007103～9856103。其中，CVA9、ECHO6、ECHO7、ECHO25血清型山東株與來自中國(guó)其他省份和世界各地的分離株存在共同的進(jìn)化祖先，而CVB3、ECHO11、ECHO14、ECHO19、ECHO30血清型山東株僅與中國(guó)其他省份的相應(yīng)毒株有共同的祖先起源。主要結(jié)論1CVA9、CVB3、CVB5、ECHO6、ECHO7、ECHO11、ECHO14、ECHO19、ECHO25、ECHO30血清型為山東省HEVB優(yōu)勢(shì)血清型。在長(zhǎng)達(dá)22年的AFP和AM疾病監(jiān)測(cè)中，本研究所選10個(gè)血清型毒株在山東省歷年分離數(shù)明顯高于其他HEV血清型別，并且在山東省局部地區(qū)曾多次引起AM等相關(guān)疾病的暴發(fā)流行，為山東省內(nèi)共循環(huán)毒株的HEVB優(yōu)勢(shì)血清型。2基因重組是HEV非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)重要的進(jìn)化方式。HEVB山東株在3D進(jìn)化樹中劃分為13個(gè)主要的基因簇，各基因簇中HEVB血清型種類和數(shù)量不同。同一血清型山東株位于多個(gè)基因簇，而不同基因簇的主要分離時(shí)間不完全相同。提示HEVB山東株非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因片段轉(zhuǎn)移頻繁，存在活躍的基因重組。3HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型VP1區(qū)核苷酸變異活躍，在山東省內(nèi)存在多個(gè)傳播鏈的共同流行。重構(gòu)VP1區(qū)流行史發(fā)現(xiàn)，HEVB山東株優(yōu)勢(shì)血清型的共同祖先起源于97年前，同一血清型的不同傳播鏈在不同的時(shí)期進(jìn)化速度不一致，提示HEV山東株在人群中的進(jìn)化不符合勻速增長(zhǎng)模型和嚴(yán)格分子鐘進(jìn)化方式。

簡(jiǎn)介：乙型肝炎病毒HBV原型病毒PROTOTYPE或稱野毒株WILDTYPE包括多種在地域和種族分布上有所差異的毒株表現(xiàn)為HIBV不同的血清型和基因型HBV變異株是指基因型以外的改變其核苷酸和或氨基酸與同型的代表株或共有列比較有獨(dú)特的變化HBV較一般DNA病毒有更高的突變率HBV的各個(gè)基因區(qū)及多數(shù)調(diào)控元件中都可發(fā)生變異變異類型有點(diǎn)突變、缺失、重復(fù)、插入、重排等HBV變異株與其致病性的改變、免疫逃逸、持續(xù)感染、以及產(chǎn)生耐藥性等均相關(guān)研究不同HBV變異株基因組的結(jié)構(gòu)與功能可深化對(duì)HBV致病機(jī)理的研究并能揭示HBV新的作用位點(diǎn)及抑制病毒的靶標(biāo)提出新的研究起點(diǎn)HBV的包膜蛋白可誘生機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體抗HBS對(duì)乙型肝炎的免疫預(yù)防、治療有重要意義HBVS基因變異可改變HBSAG的抗原性、免疫原性對(duì)乙型肝炎的診斷和預(yù)防有潛在的影響此外S基因變異可能同時(shí)造成與之完全重疊的P基因變異而影響病毒的復(fù)制繼而影響病毒的感染性和致病性PRES蛋白與HBV結(jié)合肝細(xì)胞膜及HBV的裝配和釋放有關(guān)PRES區(qū)某些缺失變異可改變病毒形態(tài)或?qū)е虏《景さ鞍追置谑д{(diào)而與肝細(xì)胞病變有關(guān)為開展中國(guó)HBV株的結(jié)構(gòu)與功能基因組學(xué)研究該論文重點(diǎn)研究了中國(guó)自然存在HBV包膜基因變異株基因組的結(jié)構(gòu)與功能包括HBV基因組克隆及細(xì)胞轉(zhuǎn)染的研究復(fù)制功能不同的兩株HBV基因組結(jié)構(gòu)分析與抗原表達(dá)的比較HBSAG129位GLN→LEU新異株129L功能基因組研究

簡(jiǎn)介：近年來隨著5種肝炎病毒AE的發(fā)現(xiàn)有80﹪90﹪的病毒性肝炎病例得到了很好的解釋在剩下的10﹪20﹪的病例中病人雖然有典型的病毒性肝炎的癥狀卻檢測(cè)不到已知的五種肝炎病毒的血清學(xué)標(biāo)志物而1989年HCV和1990年HEV的發(fā)現(xiàn)使我們堅(jiān)信所有病毒性肝炎都應(yīng)該是由相應(yīng)的病原體引起的因此人們一直在努力尋找隱藏在這些原因不明的病毒性肝炎背后的病原體1999年6月DIASINRESEARCHCENTRE的PANIELLIPRIMI領(lǐng)導(dǎo)的研究小組研究人員在一個(gè)首寫名為SEN的HIV靜脈吸毒者患者血液中發(fā)現(xiàn)了一種新的DNA病毒將其稱作SEN病毒目前對(duì)SEN病毒的研究才剛剛起步對(duì)它的認(rèn)識(shí)還很不全面對(duì)其致病性也未有系統(tǒng)深入的研究該研究的目的在于對(duì)SEN病毒中懷疑與不明原因輸血后肝炎有關(guān)的兩個(gè)亞型SENVD和SENVH的分子生物學(xué)特性以及它們?cè)谥袊?guó)各類人群中的流行情況進(jìn)行初步研究并希望從中得到確定SEN病毒致病性的有用信息

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簡(jiǎn)介：分子生物學(xué)研究表明流感病毒的血凝素HA基因與流行規(guī)模最密切只有HA蛋白分子上抗原決定簇區(qū)的氨基酸替換才能引起抗原性變異該研究對(duì)在河北省分離到的甲亞型HN流感病毒HA基因進(jìn)行了核苷酸序列測(cè)定并結(jié)合抗原性分析資料以探索地方毒株的型別變遷和基因變異規(guī)律及時(shí)抓住有意義變異株指導(dǎo)今后流感的監(jiān)測(cè)、診斷及試劑和疫苗研制甲亞型流感病毒株的新變種多首發(fā)于北方故河北省流行毒株在目前流感病毒HN亞型的變異和流行中可能具有重要作用結(jié)論1、199798流感流行期分離到6株甲亞型流感病毒抗原性接近于A京防186與A北京26295有大變異2、基因分析表明1997年中國(guó)出現(xiàn)了甲亞型新變異株在制備診斷試劑和疫苗時(shí)需要用此類毒株3、核苷酸序列測(cè)定結(jié)合抗原性分析可更準(zhǔn)確地闡明病毒變異情況

簡(jiǎn)介：輪狀病毒屬于呼腸病毒科，是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的主要病原體，每年全世界死于輪狀病毒感染的兒童約達(dá)611000。輪狀病毒具有三層衣殼，其基因組由11個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA組成，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)交叉反應(yīng)性抗原的不同，輪狀病毒分為AG7個(gè)組，其中只有A、B、C三個(gè)組可以感染人類，而引起嬰幼兒腹瀉的主要為A組，該組是最常見也是最為重要的。A組輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3為分子量36KDA的同二聚體，其N端可以結(jié)合輪狀病毒MRNA3’末端的組特異性四核苷酸共有序列，C端與POLYA結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合真核翻譯起始因子ELF4G。NSP3能夠關(guān)閉宿主細(xì)胞MRNA的翻譯，并且可能在輪狀病毒基因組復(fù)制和病毒形態(tài)發(fā)生中起重要作用。本研究克隆了A組人輪狀病毒TBCHEN株NSP3編碼基因，應(yīng)用質(zhì)粒PETI_，作為表達(dá)載體構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒PETNSP3，并在大腸桿菌BL21DE3中高效表達(dá)了重組蛋白NSP3，目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白量的286％。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離回收的方法有效地純化了目的蛋白，并制備了該重組蛋白的免疫豚鼠血清抗體，WESTERNBLOT分析顯示該血清抗體能與重組蛋白NSP3發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示在輪狀病毒感染的MA104細(xì)胞中NSP3分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。NSP3在細(xì)胞質(zhì)中分布形式不一致有的分布彌散、均勻；有的既有彌散分布，又呈現(xiàn)顆粒狀，并且這些顆粒更多地出現(xiàn)在細(xì)胞核周圍。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究TBCHEN株輪狀病毒NSP3的結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：本文為了進(jìn)一步了解我國(guó)PUUV病毒在宿主動(dòng)物中的流行情況，加強(qiáng)我國(guó)腎綜合征出血熱的防治，進(jìn)行了以下的研究1對(duì)我國(guó)吉林省和內(nèi)蒙古地區(qū)的岸鼠平進(jìn)行了PUUV病毒感染情況調(diào)查。1應(yīng)用RTPCR技術(shù)首次在我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)捕捉的紅背中發(fā)現(xiàn)PUUV。2于2005年和2006年在吉林省撫松市共采集了277份標(biāo)本，使用IFA和RTPCR分別檢測(cè)了標(biāo)本中病毒抗原和核酸。發(fā)現(xiàn)此次標(biāo)本中的PUUV病毒序列與在該地區(qū)2002年所發(fā)現(xiàn)的存在著較大差異。發(fā)現(xiàn)不同年份宿主動(dòng)物的PUUV感染率存在著較大的差異。2普馬拉病毒新亞型S片段和M片段基因的獲得及遺傳學(xué)研究。1成功地獲得了S片段和M片段基因全序列。2對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行了遺傳學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)與其它普馬拉病毒株S片段序列的核苷酸同源性為682％756％，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為929％977％。全長(zhǎng)M片段與其它普馬拉病毒M片段序列的核苷酸同源性為687％730％，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為900％928％。證實(shí)我國(guó)存在著普馬拉病毒的新亞型。3對(duì)病毒分離進(jìn)行了嘗試。本課題進(jìn)行了中國(guó)普馬拉病毒株的病毒學(xué)、遺傳學(xué)研究，在我國(guó)發(fā)現(xiàn)了PUUV新亞型，發(fā)現(xiàn)我國(guó)東北地區(qū)不同年份棕背的PUUV感染率不同。此外，在我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)存在PUUV病毒感染。對(duì)我國(guó)腎綜合征出血熱的防治提供了有益的幫助和依據(jù)。

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建人生存素SURVIVIN、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Β3TGFΒ3、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1TIMP1三基因過表達(dá)慢病毒載體，通過一次轉(zhuǎn)染，實(shí)現(xiàn)SURVIVIN、TGFΒ3、TIMP1三基因在人退變椎間盤髓核細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通過抑制細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成及抑制其降解，實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)或延緩椎間盤退變的目的。方法構(gòu)建SURVIVIN、TGFΒ3、TIMP1慢病毒載體，聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞，應(yīng)用REALTIMEPCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三基因的過表達(dá)情況，并檢測(cè)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的MRNA表達(dá)量，應(yīng)用WESTERNBLOT檢測(cè)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的蛋白含量，應(yīng)用CASPASE3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CASPASE3蛋白活性，應(yīng)用ANNEXINⅤPI雙染色法檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率。結(jié)果人退變髓核細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，REALTIMEPCR結(jié)果顯示SURVIVIN、TGFΒ3、TIMP1三基因在基因水平均獲得穩(wěn)定過表達(dá)，且其表達(dá)能維持細(xì)胞傳至P3代或更長(zhǎng)時(shí)間。目的病毒轉(zhuǎn)染組（A組）較空病毒轉(zhuǎn)染組（B組）、空白對(duì)照組（C組），蛋白多糖和Ⅱ型膠原MRNA表達(dá)量均無明顯差異，WESTERNBLOT示蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白含量三組無明顯差異，CASPASE3蛋白吸光度及髓核細(xì)胞凋亡率三組亦無明顯差異。結(jié)論SURVIVIN、TGFΒ3、TIMP1慢病毒載體能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人退變椎間盤髓核細(xì)胞，并且能長(zhǎng)時(shí)間維持其表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，三基因?qū)υ隗w外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的合成并無明顯的作用，對(duì)細(xì)胞凋亡亦無明顯抑制作用。在體外，通過SURVIVIN、TGFΒ3、TIMP1慢病毒載體轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞并不能有效增加蛋白多糖和Ⅱ型膠原的含量，亦不能有效抑制髓核細(xì)胞凋亡。而在體內(nèi)環(huán)境中，三基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染的作用，仍需進(jìn)一步研究。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)密級(jí)UDC編號(hào)學(xué)位論文MICRNA100抑制劑慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)BEAS2B細(xì)胞行為學(xué)的影響CONSTRUCTIONOFLENTIVIRALEXPRESSIONVECTWITHMICRNA100INHIBITITSEFFECTONTHECELLULARBEHAVIOFBEAS2B董偉指導(dǎo)教師姓名汪思應(yīng)教授安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)名稱病理學(xué)與病理生理學(xué)提交論文日期201503論文答辯日期201505學(xué)位授予單位和日期安徽醫(yī)科大學(xué)答辯委員會(huì)主席評(píng)閱人2015年5月學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名日期學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解安徽醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國(guó)家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版，有權(quán)允許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館被查閱，有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。愿意將本人的學(xué)位論文提交中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫、中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫和中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫中全文發(fā)表，并可以以電子、網(wǎng)絡(luò)及其他數(shù)字媒體形式公開出版，并同意編入CNKI中國(guó)知識(shí)資源總庫，在中國(guó)博碩士學(xué)位論文評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫中使用和在互聯(lián)網(wǎng)上傳播。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。學(xué)位論文作者簽名導(dǎo)師簽名日期日期

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簡(jiǎn)介：甲型流感病毒嚴(yán)重危害人類健康，由于其變異引發(fā)的大流行對(duì)人類造成嚴(yán)重威脅，近年來人感染禽流感病毒H5N1和甲型H1N1流感的流行，進(jìn)一步提示加強(qiáng)甲型流感病毒的研究和控制的重要性。血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA是甲型流感病毒編碼的糖蛋白，變異性強(qiáng)，根據(jù)抗原性不同可進(jìn)一步分為16個(gè)HA亞型H1～H16和9個(gè)NA亞型N1～N9。盡管HA和NA是流感病毒主要的免疫原，但由于HA和NA的變異性強(qiáng)，亞型眾多，而目前甲型流感病毒16個(gè)HA和9個(gè)NA不同亞型之間的免疫交叉關(guān)系尚未系統(tǒng)研究，對(duì)流感病毒亞型特異性免疫檢測(cè)技術(shù)的建立和疫苗的研發(fā)提出了嚴(yán)峻的考驗(yàn)。為此，本研究對(duì)甲型流感病毒16個(gè)亞型的HA1和9個(gè)亞型NA的交叉反應(yīng)性進(jìn)行了研究，以期闡明其免疫反應(yīng)特征，為甲型流感病毒免疫檢測(cè)技術(shù)和通用疫苗的研制提供可行性的理論依據(jù)。另一方面，近年來反向遺傳系統(tǒng)的發(fā)明為人工改造甲型流感病毒和研發(fā)疫苗提供了關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)，但現(xiàn)有系統(tǒng)的拯救效率有待提高，本研究擬通過對(duì)甲型流流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體的改建提高其拯救效率。一、甲型流感病毒HA和NA血清學(xué)交叉反應(yīng)特征研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)選取的甲型流感病毒16個(gè)亞型的HA基因和9個(gè)亞型的NA基因的序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，16個(gè)HA和9個(gè)NA的核苷酸與氨基酸序列的進(jìn)化樹都主要向兩個(gè)趨勢(shì)進(jìn)化，16個(gè)HA核苷酸序列之間的同源率在28％～767之間，其氨基酸序列之間的同源率在362～785之間，9個(gè)NA亞型核苷酸序列之間的同源率在431～704之間，其氨基酸序列之間的同源率在379～666之間。盡管16個(gè)HA和9個(gè)NA基因的預(yù)測(cè)B細(xì)胞線性表位分布區(qū)域一致，但其具體表位組成卻存在差異，這些信息為進(jìn)行各亞型之間的血清學(xué)交叉反應(yīng)以及確定亞型特異性表位序列提供研究方向，進(jìn)而為研究HA和NA的結(jié)構(gòu)與功能、免疫識(shí)別、構(gòu)建HA和NA的突變體以及選擇表達(dá)新型HA和NA分子、研發(fā)診斷和基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。隨后將PCR擴(kuò)增的經(jīng)密碼子優(yōu)化的16個(gè)HA1和9個(gè)NA基因克隆到改建的GP67PFASTBAC1載體中，獲得了25個(gè)重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒分別感染SF9細(xì)胞，分別收取上清和細(xì)胞用抗6HIS抗體進(jìn)行WESTERNBLOT分析。結(jié)果表明，16個(gè)HA1和9個(gè)NA基因的表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量分別約為525KD與716KD，與預(yù)期相符，并且16個(gè)HA1和9個(gè)NA基因還呈分泌性表達(dá)。其中H5HA1和H9HA1經(jīng)NI柱純化后的純度達(dá)90左右，回收率分別為05和09。同時(shí)，將16個(gè)亞型的HA和9個(gè)亞型的NA基因克隆到5型重組腺病毒載體中，得到了25個(gè)重組腺病毒。分別將25個(gè)重組腺病毒通過滴鼻途徑免疫BALBC小鼠，制備了相應(yīng)亞型的抗體，三次免疫后ELISA檢測(cè)陽轉(zhuǎn)率為100，ELISA檢測(cè)的抗體效價(jià)約為1∶6400左右。利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的各個(gè)亞型的目的蛋白作為抗原，利用重組腺病毒免疫BALBC小鼠制備的血清作為抗體，通過ELISA方法確定16個(gè)HA亞型及9個(gè)NA亞型之間的血清學(xué)交叉反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，HA1和NA各亞型之間的交叉反應(yīng)關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，H2、H5、H7亞型與其他亞型之間的交叉反應(yīng)弱，而H6、H12、H16與其他亞型之間的交叉反應(yīng)強(qiáng)。N1、N2亞型與其他亞型之間的交叉反應(yīng)強(qiáng)，HA1和NA各亞型之間的交叉反應(yīng)結(jié)果與其序列分析的結(jié)果存在一定的差異。二、甲型流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的優(yōu)化利用RTPCR的方法擴(kuò)增了甲型流感病毒APR834H1N1毒株8個(gè)基因片斷，克隆入PⅣⅦ載體中，其中在PB1片段中引入了3個(gè)沉默突變標(biāo)簽。將8個(gè)功能質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T和MDCK混合培養(yǎng)細(xì)胞，利用細(xì)胞病變、RTPCR、電鏡技術(shù)等證明該系統(tǒng)可成功拯救甲型流感病毒。為提高甲型流感病毒的拯救效率，用人工合成的SCPI啟動(dòng)子1插入PⅣⅦ載體，構(gòu)建出PⅣVS質(zhì)粒，再將APR834H1N1的8個(gè)基因片斷克隆入PⅣVS載體中，把優(yōu)化后的8個(gè)功能質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T和MDCK混合細(xì)胞，在共轉(zhuǎn)染后的24H、48H、72H及96H分別收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清和細(xì)胞，通過EGFP表達(dá)量、NP表達(dá)的時(shí)相變化以及血凝試驗(yàn)鑒定兩個(gè)包裝系統(tǒng)的拯救效率。結(jié)果表明，優(yōu)化后系統(tǒng)不同時(shí)間點(diǎn)的EGFP表達(dá)量、NP表達(dá)量及血凝效價(jià)均高于未優(yōu)化系統(tǒng)，說明利用高強(qiáng)度的SCPI啟動(dòng)子可有效提高甲型流感病毒的包裝效率，為改進(jìn)甲型流感病毒疫苗的研發(fā)系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。