乳腺癌相關(guān)的新型人雌激受體hERα剪接變體ERα30的克隆及其功能和作用機(jī)制的研究.pdf

1、選擇性剪接從相同的基因產(chǎn)生許多不同的mRNA（剪接變體），使得有限數(shù)量的基因可以編碼多種不同的蛋白質(zhì)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，剪接變體在癌癥的發(fā)展，臨床診斷和治療中均具有重要作用。從20世紀(jì)90年代初到現(xiàn)在，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多人雌激素受體α(hERα)剪接變體，大多數(shù)具有一個(gè)或多個(gè)外顯子的缺失并且可以表達(dá)為蛋白質(zhì)。有的剪接變體可調(diào)控全長(zhǎng)型hERα(ERα66)的功能。它們?cè)谌橄侔┑男纬珊瓦M(jìn)展期間可能變得異常，從而通過(guò)某些未知的機(jī)制對(duì)乳腺癌

2、細(xì)胞的行為產(chǎn)生影響，并且可以促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展，例如失去對(duì)抗雌激素治療反應(yīng)性。
　　本研究首先從一例三陰性乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)并克隆了一種新的hERα剪接變體，命名為ERα30。該剪接變體的剪接方式較為特殊，將hERα基因外顯子4的前24bp直接剪接至外顯子6的最后44bp。由于外顯子5和外顯子7的完全缺失，ERα30的開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)了具有30kDa分子量的截短型蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)的全長(zhǎng)型ERα66不同的是，ERα30缺乏配體結(jié)合域以及配體

3、依賴的轉(zhuǎn)錄激活域(LBD/AF2)，保留N端轉(zhuǎn)錄激活域(AF1)，DNA結(jié)合域(DBD)和部分絞鏈區(qū)(Hinge)，在其C端具有一段特殊的10個(gè)氨基酸序列的區(qū)域。我們運(yùn)用RT-PCR的方法檢測(cè)了33例原發(fā)性乳腺癌組織標(biāo)本中ERα30 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)11個(gè)標(biāo)本(33.3％)在mRNA水平上表達(dá)ERα30。ERa30表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性分析顯示ERα30在ERa66、孕激素受體(PR)陰性乳腺癌中的表達(dá)高于ERα66、PR陽(yáng)性乳腺癌

4、，與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、臨床分期、HER-2表達(dá)狀態(tài)之間的關(guān)系不大。
　　隨后，我們構(gòu)建了含ERα30的真核表達(dá)載體pEGFP-N1/ERα30，轉(zhuǎn)染ERα陰性的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，通過(guò)G418篩選獲得ERα30過(guò)表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/ERα30。Western Blot檢出截短型的30kDa蛋白質(zhì)在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的表達(dá)，同時(shí)我們采用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、平板克隆形成試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞

5、的克隆形成率、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)移侵襲能力。研究結(jié)果表明，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系MDA-MB-231/ERα30的相對(duì)增殖率、克隆形成率及轉(zhuǎn)移侵襲能力均高于對(duì)照組。
　　最后，我們構(gòu)建ERα30-EGFP融合表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)ERα30-EGFP融合蛋白在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)定位于細(xì)胞核中，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，ERα30上調(diào)EGFR和c-jun的表達(dá)，提示ERα30可能介導(dǎo)“非經(jīng)典”的信號(hào)途徑，例如配體

6、非依賴性ERα30信號(hào)途徑，即通過(guò)上調(diào)EGFR的表達(dá)激活生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑和ERE非依賴性信號(hào)途徑，即通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用穩(wěn)定c-jun與DNA的結(jié)合而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。
　　總之，我們發(fā)現(xiàn)并克隆了一種新的人雌激素受體α(hERα)剪接變體，ERα30;并對(duì)其功能和作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。然而，仍有許多科學(xué)問(wèn)題尚未解決，需要進(jìn)一步的深入研究來(lái)明確ERα30在人類乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的意義