鹽霉素通過下調(diào)microRNA-221抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,是造成全球女性死亡的第二大腫瘤。腫瘤中一小部分具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞,在維持腫瘤生長、促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移以及放化療抵抗中起重要作用,被稱為腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)在白血病、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中被證實存在。CD44+/CD24-和乙醛脫氫酶1(ALDH1)等被用作乳腺癌干細(xì)胞篩選標(biāo)記物。
  鹽霉素是一種元羧酸聚醚類抗生素,最初被用于治療家禽類的球蟲病。近來

2、有研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素對乳腺癌干細(xì)胞的殺傷作用是乳腺癌最常用的化療藥物紫杉醇的100倍,但其選擇性殺傷乳腺癌干細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。有報道鹽霉素可通過靶向Hedgehog信號通路而抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖。在骨肉瘤和胃癌中,鹽霉素可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而對干細(xì)胞起到細(xì)胞毒性作用。
  microRNAs(miRNAs)是一種長度在19-25個核苷酸的單鏈非編碼小RNA分子,其通過堿基互補配對方式與靶基因mRNA3'U

3、TR區(qū)域結(jié)合,導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯,在增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。miRNAs異常表達(dá)與乳腺癌干細(xì)胞增殖有關(guān)。其中 microRNA-221(miR-221)在乳腺癌細(xì)胞MCF-7形成的乳腺球中表達(dá)增高,MCF-7乳腺球細(xì)胞可在裸鼠產(chǎn)生更大的移植瘤,miR-221可能通過靶向調(diào)節(jié)ER-α和ATXN1等誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程,或者通過抑制DNMT3b表達(dá),增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞干性。此外,抑癌基因ph

4、osphatase and tensin homolog(PTEN)在胃癌和宮頸癌中被證明是miR-221的直接靶點,而PTEN失活可促進(jìn)其下游的PI3K/Akt信號通路活性,在正常乳腺干細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞中起重要調(diào)控作用。
  目的:(1)探討miR-221促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞增殖與PTEN/PI3K/Akt信號通路的關(guān)系;(2)探討鹽霉素選擇性殺傷乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞的作用與 miR-221及其調(diào)控的PTEN/PI3K/Akt信號通路

5、的關(guān)系。
  方法:(1)以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為實驗對象,利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染miR-221 mimic(miR-221)、miRNA無關(guān)序列(NC)和PTEN siRNA(siPTEN)。Taqman探針法qRT-PCR檢測miR-221表達(dá)水平。CCK-8和平板克隆實驗檢測miR-221上調(diào)或 PTEN敲低對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。乳腺球微球體培養(yǎng)實驗檢測miR-221上調(diào)或PTEN敲低對乳腺癌干細(xì)胞

6、增殖能力的影響。SYBR Green染料法qRT-PCR檢測PTEN mRNA水平,Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)和 COX-2,以及乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物 ALDH1表達(dá)。探討miR-221促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞增殖的機(jī)制。
 ?。?)CCK-8實驗檢測鹽霉素在MCF-7細(xì)胞中的半數(shù)致死濃度(IC50)。乳腺球微球體培養(yǎng)實驗檢測鹽霉素對 miR-221上調(diào)的乳腺癌細(xì)

7、胞成球能力的影響,Taqman探針法qRT-PCR檢測鹽霉素作用后miR-221水平變化,SYBR Green染料法qRT-PCR檢測PTEN mRNA水平,Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)和COX-2,以及乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1表達(dá)。體外實驗探討鹽霉素抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖與miR-221及其調(diào)節(jié)的信號通路的關(guān)系。
 ?。?)慢病毒表達(dá)載體LV-hsa-miR-22

8、1感染MCF-7細(xì)胞,裸鼠右側(cè)腹部皮下注射1?106個細(xì)胞。待腫瘤體積達(dá)到100mm3時,將裸鼠隨機(jī)分為兩組,一組鹽霉素4mg/kg腹腔注射,隔天一次,另一組注射等劑量DMSO。定期觀察并測量裸鼠體重和腫瘤大小。給藥7次后處死裸鼠,取出移植瘤組織。部分提取RNA,實時熒光qRT-PCR檢測miR-221和PTEN mRNA水平;部分提取蛋白質(zhì),Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)和

9、COX-2,以及乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1表達(dá)。體內(nèi)實驗探討鹽霉素抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖與miR-221及其調(diào)節(jié)的信號通路的關(guān)系。
  結(jié)果:(1)實時熒光qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示miR-221組和siPTEN組PTEN mRNA和蛋白水平均顯著低于陰性對照Control組和NC組(P<0.05)。
  (2)平板克隆實驗結(jié)果顯示,miR-221組細(xì)胞克隆數(shù)為730±40.4,與Control組(40

10、0±23.1)和NC組(454±50.3)相比,差異顯著(P<0.05),而與siPTEN組(870.8±78.2)相比則無顯著差異(P>0.05)。CCK-8結(jié)果顯示miR-221組和siPTEN組與Control和NC組相比,細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。乳腺球培養(yǎng)實驗顯示miR-221組和siPTEN組形成的乳腺球體積明顯比Control組和NC組大,進(jìn)而統(tǒng)計孔板內(nèi)微球體數(shù)目,結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-221組形成281±17.5個乳腺球,siP

11、TEN組為306±12.3個,均顯著多于Control組(200±23.1)和NC組(181±23.5),P值均小于0.05。Western blot顯示miR-221轉(zhuǎn)染和PTEN敲低可使ALDH1蛋白表達(dá)明顯增多,PTEN下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)和COX-2表達(dá)也明顯增高。
  (3)Taqman探針法qRT-PCR結(jié)果顯示鹽霉素能明顯降低MCF-7細(xì)胞內(nèi)源性miR-221表達(dá)水平(P<0.05);

12、藥物作用曲線結(jié)果表明鹽霉素半數(shù)致死濃度(IC50)為1μM,用于鹽霉素相關(guān)實驗。與miR-221組相比,鹽霉素處理組(Sal-miR-221)乳腺球體積明顯變小,數(shù)量明顯減少(117±9.4 vs180±15.6,P<0.05),ALDH1蛋白表達(dá)明顯降低。實時熒光 qRT-PCR結(jié)果顯示鹽霉素作用后 MCF-7細(xì)胞(Sal-miR-221組)中miR-221水平明顯降低(P<0.05),而PTEN mRNA水平顯著升高(P<0.05,

13、Western blot顯示PTEN蛋白表達(dá)也增高,PTEN下游因子p-Akt、p65和p-p65以及COX-2表達(dá)均增高。
 ?。?)鹽霉素給藥組裸鼠皮下瘤體積明顯小于對照組,皮下瘤組織內(nèi) miR-221表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05),PTEN mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),PTEN蛋白增高,其下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)以及COX-2表達(dá)均降低,干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1表達(dá)亦明顯降低。

14、
  結(jié)論:(1)在乳腺癌細(xì)胞中miR-221可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制PTEN表達(dá)。
 ?。?)miR-221促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞增殖,可能與 miR-221下調(diào)PTEN表達(dá),導(dǎo)致其下游Akt磷酸化,激活NF-κB信號通路,促進(jìn)COX-2表達(dá)有關(guān)。
 ?。?)體內(nèi)外實驗結(jié)果表明鹽霉素抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖能力,可能通過降低miR-221水平,進(jìn)而升高PTEN表達(dá),使其下游因子Akt去磷酸化,抑制NF-κB活性和COX-

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