鹽霉素通過下調(diào)microRNA-221抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，是造成全球女性死亡的第二大腫瘤。腫瘤中一小部分具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，在維持腫瘤生長、促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移以及放化療抵抗中起重要作用，被稱為腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)在白血病、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中被證實存在。CD44+/CD24-和乙醛脫氫酶1（ALDH1）等被用作乳腺癌干細(xì)胞篩選標(biāo)記物。
　　鹽霉素是一種元羧酸聚醚類抗生素，最初被用于治療家禽類的球蟲病。近來

2、有研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素對乳腺癌干細(xì)胞的殺傷作用是乳腺癌最常用的化療藥物紫杉醇的100倍，但其選擇性殺傷乳腺癌干細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。有報道鹽霉素可通過靶向Hedgehog信號通路而抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖。在骨肉瘤和胃癌中，鹽霉素可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而對干細(xì)胞起到細(xì)胞毒性作用。
　　microRNAs（miRNAs）是一種長度在19-25個核苷酸的單鏈非編碼小RNA分子，其通過堿基互補配對方式與靶基因mRNA3'U

3、TR區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，在增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。miRNAs異常表達(dá)與乳腺癌干細(xì)胞增殖有關(guān)。其中 microRNA-221（miR-221）在乳腺癌細(xì)胞MCF-7形成的乳腺球中表達(dá)增高，MCF-7乳腺球細(xì)胞可在裸鼠產(chǎn)生更大的移植瘤，miR-221可能通過靶向調(diào)節(jié)ER-α和ATXN1等誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，或者通過抑制DNMT3b表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞干性。此外，抑癌基因ph

4、osphatase and tensin homolog（PTEN）在胃癌和宮頸癌中被證明是miR-221的直接靶點，而PTEN失活可促進(jìn)其下游的PI3K/Akt信號通路活性，在正常乳腺干細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞中起重要調(diào)控作用。
　　目的：（1）探討miR-221促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞增殖與PTEN/PI3K/Akt信號通路的關(guān)系；（2）探討鹽霉素選擇性殺傷乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞的作用與 miR-221及其調(diào)控的PTEN/PI3K/Akt信號通路

5、的關(guān)系。
　　方法：（1）以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為實驗對象，利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染miR-221 mimic（miR-221）、miRNA無關(guān)序列（NC）和PTEN siRNA（siPTEN）。Taqman探針法qRT-PCR檢測miR-221表達(dá)水平。CCK-8和平板克隆實驗檢測miR-221上調(diào)或 PTEN敲低對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。乳腺球微球體培養(yǎng)實驗檢測miR-221上調(diào)或PTEN敲低對乳腺癌干細(xì)胞

6、增殖能力的影響。SYBR Green染料法qRT-PCR檢測PTEN mRNA水平，Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）和 COX-2，以及乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物 ALDH1表達(dá)。探討miR-221促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　?。?）CCK-8實驗檢測鹽霉素在MCF-7細(xì)胞中的半數(shù)致死濃度（IC50）。乳腺球微球體培養(yǎng)實驗檢測鹽霉素對 miR-221上調(diào)的乳腺癌細(xì)

7、胞成球能力的影響，Taqman探針法qRT-PCR檢測鹽霉素作用后miR-221水平變化，SYBR Green染料法qRT-PCR檢測PTEN mRNA水平，Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）和COX-2，以及乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1表達(dá)。體外實驗探討鹽霉素抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖與miR-221及其調(diào)節(jié)的信號通路的關(guān)系。
　?。?）慢病毒表達(dá)載體LV-hsa-miR-22

8、1感染MCF-7細(xì)胞，裸鼠右側(cè)腹部皮下注射1?106個細(xì)胞。待腫瘤體積達(dá)到100mm3時，將裸鼠隨機(jī)分為兩組，一組鹽霉素4mg/kg腹腔注射，隔天一次，另一組注射等劑量DMSO。定期觀察并測量裸鼠體重和腫瘤大小。給藥7次后處死裸鼠，取出移植瘤組織。部分提取RNA，實時熒光qRT-PCR檢測miR-221和PTEN mRNA水平；部分提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）和

9、COX-2，以及乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1表達(dá)。體內(nèi)實驗探討鹽霉素抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖與miR-221及其調(diào)節(jié)的信號通路的關(guān)系。
　　結(jié)果：（1）實時熒光qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示miR-221組和siPTEN組PTEN mRNA和蛋白水平均顯著低于陰性對照Control組和NC組（P<0.05）。
　　（2）平板克隆實驗結(jié)果顯示，miR-221組細(xì)胞克隆數(shù)為730±40.4，與Control組（40

10、0±23.1）和NC組（454±50.3）相比，差異顯著（P<0.05），而與siPTEN組（870.8±78.2）相比則無顯著差異（P>0.05）。CCK-8結(jié)果顯示miR-221組和siPTEN組與Control和NC組相比，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。乳腺球培養(yǎng)實驗顯示miR-221組和siPTEN組形成的乳腺球體積明顯比Control組和NC組大，進(jìn)而統(tǒng)計孔板內(nèi)微球體數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-221組形成281±17.5個乳腺球，siP

11、TEN組為306±12.3個，均顯著多于Control組（200±23.1）和NC組（181±23.5），P值均小于0.05。Western blot顯示miR-221轉(zhuǎn)染和PTEN敲低可使ALDH1蛋白表達(dá)明顯增多，PTEN下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）和COX-2表達(dá)也明顯增高。
　　（3）Taqman探針法qRT-PCR結(jié)果顯示鹽霉素能明顯降低MCF-7細(xì)胞內(nèi)源性miR-221表達(dá)水平（P<0.05）；

12、藥物作用曲線結(jié)果表明鹽霉素半數(shù)致死濃度（IC50）為1μM，用于鹽霉素相關(guān)實驗。與miR-221組相比，鹽霉素處理組（Sal-miR-221）乳腺球體積明顯變小，數(shù)量明顯減少（117±9.4 vs180±15.6，P<0.05），ALDH1蛋白表達(dá)明顯降低。實時熒光 qRT-PCR結(jié)果顯示鹽霉素作用后 MCF-7細(xì)胞（Sal-miR-221組）中miR-221水平明顯降低（P<0.05），而PTEN mRNA水平顯著升高（P<0.05，

13、Western blot顯示PTEN蛋白表達(dá)也增高，PTEN下游因子p-Akt、p65和p-p65以及COX-2表達(dá)均增高。
　?。?）鹽霉素給藥組裸鼠皮下瘤體積明顯小于對照組，皮下瘤組織內(nèi) miR-221表達(dá)水平明顯低于對照組（P<0.05），PTEN mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），PTEN蛋白增高，其下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）以及COX-2表達(dá)均降低，干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1表達(dá)亦明顯降低。

14、
　　結(jié)論：（1）在乳腺癌細(xì)胞中miR-221可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制PTEN表達(dá)。
　?。?）miR-221促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞增殖，可能與 miR-221下調(diào)PTEN表達(dá)，導(dǎo)致其下游Akt磷酸化，激活NF-κB信號通路，促進(jìn)COX-2表達(dá)有關(guān)。
　?。?）體內(nèi)外實驗結(jié)果表明鹽霉素抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖能力，可能通過降低miR-221水平，進(jìn)而升高PTEN表達(dá)，使其下游因子Akt去磷酸化，抑制NF-κB活性和COX-