TGF-β1在乳腺癌微環(huán)境誘導腫瘤相關成纖維細胞形成的機制研究.pdf

1、腫瘤微環(huán)境已經(jīng)成為腫瘤治療的重要靶點。對于許多實體瘤而言，尤其是癌組織，他們的微環(huán)境由腫瘤細胞本身、內皮細胞、免疫細胞和成纖維細胞組成，通過分泌細胞因子或者細胞之間互相作用促進腫瘤的發(fā)生。尤其是腫瘤相關成纖維細胞（CAFs），是腫瘤微環(huán)境中激活的成纖維細胞，在腫瘤的發(fā)展進程和轉移中起著重要作用。TGF-β1作為一個轉化生長因子，在腫瘤微環(huán)境起著重要的作用，既可以促進腫瘤的生長，也可抑制腫瘤的生長。但是，TGF-β1在腫瘤微環(huán)境中的作用機

2、制尚不明確。而且，我們的臨床結果顯示在乳腺癌病人的腫瘤組織中TGF-β1的表達與CAFs的表型標志蛋白α-SMA的表達成正相關關系，說明TGF-β1的表達與CAFs的形成有關，但是其機制有待進一步探討。
　　首先，本課題將小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3血清饑餓24 h，建立體外營養(yǎng)剝奪模型，也是為了模擬腫瘤微環(huán)境中營養(yǎng)剝奪的條件。并考察TGF-β1在一定濃度下（2.5 ng/ml）對血清饑餓的NIH3T3細胞的作用。實驗結果顯示T

3、GF-β1不僅緩解了饑餓導致的生長抑制、線粒體損傷和細胞凋亡，而且TGF-β1能夠誘導饑餓的成纖維細胞 NIH3T3的CAFs表型的形成。實驗結果還顯示，TGF-β1能夠增強經(jīng)饑餓處理NIH3T3細胞的MDC陽性率、自噬相關基因和蛋白的表達，而自噬抑制劑3-MA卻阻斷了TGF-β1的作用，降低了自噬的發(fā)生。共聚焦和電鏡的結果進一步發(fā)現(xiàn)TGF-β1增強經(jīng)饑餓處理的NIH3T3細胞自噬的發(fā)生。
　　其次，自噬是應激條件下修復細胞損傷的

4、主要機制之一，并且自噬與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也密切相關。因此，本課題以TGF-β1增強血清饑餓狀態(tài)下NIH3T3細胞自噬功能的角度研究和探討了TGF-β1緩解血清饑餓導致的細胞損傷和誘導NIH3T3細胞 CAFs的表型形成的作用機理。為此，我們依次進行了以下實驗：（1）采用自噬促進劑(Rapa)和自噬抑制劑（3-MA）探討了自噬是否參與了TGF-β1誘導的細胞保護作用和CAFs的轉變作用，實驗結果顯示自噬促進劑進一步增強TGF-β1誘導的細

5、胞增殖和線粒體功能，而自噬抑制劑則抑制了TGF-β1的作用，阻斷了TGF-β1的抗凋亡作用和CAFs轉變作用。（2）采用siRNA技術干擾Atg5后檢測自噬水平、細胞凋亡和壞死情況以及CAFs表型蛋白α-SMA和FAP-α的表達。實驗結果顯示Atg5 siRNA不僅阻斷了TGF-β1誘導的自噬的發(fā)生，而且廢除了TGF-β1對經(jīng)饑餓處理NIH3T3細胞的作用，提示自噬是TGF-β1緩解血清饑餓狀態(tài)下NIH3T3細胞損傷和誘導CAFs表型形

6、成的作用靶點。（3）我們采用TGF-βR1/ALK5抑制劑LY-2157299探討了TGF-β1介導的自噬緩解血清饑餓狀態(tài)下NIH3T3細胞損傷和誘導CAFs表型形成的具體分子機制。實驗結果發(fā)現(xiàn)LY-2157299能夠阻斷TGF-β1的經(jīng)典通路-Smad通路，而且進一步阻斷了TGF-β1誘導的自噬相關蛋白的表達和 CAFs表型標志蛋白的表達。綜合以上所有結果，我們推斷出TGF-β可以通過激活Smad通路提高線粒體自噬的水平，在營養(yǎng)剝奪狀

7、態(tài)下清除受損的線粒體和降低細胞凋亡水平，從而一定程度上修復細胞損傷；并且 TGF-β可通過 Smad/自噬通路在營養(yǎng)剝奪狀態(tài)下誘導成纖維細胞CAFs表型的形成。
　　最后，為了進一步驗證TGF-β1介導的自噬在營養(yǎng)剝奪狀態(tài)下能夠修復成纖維細胞的損傷和誘導腫瘤微環(huán)境中CAFs表型的形成，我們采用小鼠混合移植瘤模型，即小鼠乳腺癌細胞4T1和小鼠成纖維細胞NIH3T3以1：2的比例混合接入Balb/c小鼠內，從體內去探討TGF-β1誘導

8、的自噬對腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞的作用以及其對腫瘤發(fā)展進程實驗的影響。實驗結果顯示，與正常組相比，血清饑餓顯著提高了腫瘤組織的自噬水平，但是卻抑制了腫瘤的生長，增加了腫瘤組織的凋亡和壞死水平。而TGF-β1能夠顯著增強腫瘤組織的自噬水平和誘導CAFs表型的形成，并且促進了腫瘤的生長，也緩解了腫瘤組織的凋亡和壞死情況。而自噬抑制劑3-MA則抑制了TGF-β1誘導的自噬，廢除了TGF-β1誘導的CAFs轉變作用，從而抑制了腫瘤的生長。