50 Hz極低頻電磁場和1800 MHz射頻電磁場表觀遺傳學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制的研究.pdf

1、隨著科技的發(fā)展，各類電子產(chǎn)品、電力設(shè)備廣泛使用，由此產(chǎn)生的各種不同頻率的電磁場已經(jīng)成為繼空氣、噪聲和水源污染后的第四大污染，嚴(yán)重影響和威脅人類健康。極低頻電磁場（ELF-EMF）和射頻電磁場（RF-EMF）是我們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|到的最普遍的兩種電磁場。許多研究表明，ELF-EMF和RF-EMF暴露與人類健康損害和部分疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，包括兒童白血病、腦腫瘤、Lou Gehrig疾病以及老年癡呆癥病等。由于雄性生殖器官對環(huán)境有害物

2、質(zhì)非常敏感，隨著近年來精液質(zhì)量下降和不育的人群越來越多，人們開始密切關(guān)注ELF-EMF和RF-EMF對雄性生殖健康的潛在危害。然而，目前關(guān)于ELF-EMF和RF-EMF是否具有明顯的雄性生殖毒性的流行病學(xué)研究以及實驗研究結(jié)果還很不一致，而且關(guān)于ELF-EMF和RF-EMF暴露對（男）雄性生殖毒性以及機(jī)制也均不清楚。因此系統(tǒng)的開展ELF-EMF和RF-EMF生殖毒性效應(yīng)及其機(jī)制的研究，對于全面認(rèn)識二者對人類健康的影響及防治具有重要的意義。

3、
　　DNA甲基化是表觀遺傳修飾的途徑之一。它指的是在 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下將活性S-腺甲硫胺酸(SAM)轉(zhuǎn)移至DNA分子胞嘧啶環(huán)5-C位點使其轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的過程。DNA甲基化是一種廣泛的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。一般而言，基因啟動子區(qū)高甲基化會抑制其表達(dá)。因此DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用，而且廣泛參與了各種生命活動和疾病的發(fā)生。miRNA是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的另一重要途徑，作為一類內(nèi)源性非編碼小RNA（長度大約在19

4、~25核苷酸），它幾乎存在于所有的生物體中，包括動物、植物和病毒。miRNA主要的生物學(xué)功能是通過結(jié)合靶基因的3’非翻譯區(qū)從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA通過與靶基因的結(jié)合能夠抑制靶 mRNA的翻譯或提高mRNA的降解。miRNA介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)控是一種重要的表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控途徑，人類基因組中約60％的基因都受到miRNA的調(diào)控，miRNA介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)控幾乎涉及參與全部的細(xì)胞進(jìn)程，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期等，

5、且miRNA與多種人類腫瘤和男性生殖障礙密切相關(guān)。
　　越來越多的證據(jù)表明，DNA甲基化和 miRNA對精子的生成和男性的生育能力至關(guān)重要。鑒于EMF暴露對雄性生殖健康的潛在危害值得關(guān)注，但現(xiàn)有研究未得出明確的結(jié)論。存在較大爭議的原因一方面可能與無標(biāo)準(zhǔn)暴露裝置，暴露頻率、強(qiáng)度、時間不一，檢測方法和細(xì)胞敏感性不同等有關(guān)；另一方面，不少研究發(fā)現(xiàn)ELF-EMF和RF-EMF沒有明顯的遺傳毒性。因此，本研究擬從表觀遺傳學(xué)這一新的角度入手，

6、系統(tǒng)的評價EMFs暴露是否對DNA甲基化以及miRNA等主要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控產(chǎn)生影響；篩選關(guān)鍵性 DNA甲基化調(diào)控應(yīng)答基因和 miRNA，并初步分析相關(guān)的DNA甲基化調(diào)控基因和miRNA在EMFs暴露過程中的功能及其機(jī)制。為進(jìn)一步全面認(rèn)識電磁輻射的損傷效應(yīng)與醫(yī)學(xué)防護(hù)提供理論依據(jù)和研究材料。
　　本論文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）50 Hz ELF-EMF的表觀遺傳學(xué)研究
　　①以不同電場強(qiáng)度（1 mT，2 mT

7、和3 mT），間歇式暴露模式（5 min開10 min關(guān)）建立50 Hz ELF-EMF暴露條件下小鼠GC-2細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)細(xì)胞研究模型。暴露72 h后采用 CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)等分析方法發(fā)現(xiàn)，不同場強(qiáng)的50 Hz ELF-EMF暴露對GC-2細(xì)胞的形態(tài)、生長沒有明顯的影響，對GC-2細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡也沒有明顯的影響。表明50 Hz ELF-EMF短期暴露在體外沒有明顯的細(xì)胞功能改變。
　?、谌蚪MDNA甲基化水平定量分

8、析發(fā)現(xiàn)：50 Hz ELF-EMF暴露后，1 mT暴露組GC-2細(xì)胞DNA的甲基化水平明顯降低；2 mT和3 mT暴露后，GC-2細(xì)胞全基因組甲基化水平升高（P<0.05），表明50 Hz ELF-EMF暴露可以導(dǎo)致GC-2細(xì)胞DNA異常甲基化。初步的機(jī)制研究表明，在50 Hz ELF-EMF暴露條件下，DNMT1、DNMT3b的mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯改變，表明相關(guān)的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶參與了50 Hz ELF-EMF致GC-2細(xì)胞

9、全基因組甲基化水平的改變。
　　③利用DNA甲基化芯片初步篩選了50 Hz ELF-EMF暴露條件下主要的差異甲基化基因，建立了全基因組甲基化差異圖譜。其中有400多個基因發(fā)生了明顯的甲基化改變，表明50 Hz ELF-EMF暴露可能通過調(diào)控相關(guān)基因的甲基化產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。通過對部分候選基因DNA甲基化狀態(tài)的進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nod1、Lrrc9、Tagln等基因啟動子區(qū)明顯甲基化，且負(fù)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，表明相關(guān)基因不僅可以作

10、為50 Hz ELF-EMF暴露的候選標(biāo)志物，而且可能在50 Hz ELF-EMF誘發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)中起重要作用。
　?、芾帽磉_(dá)譜芯片建立了50 Hz ELF-EMF暴露下差異基因表達(dá)譜。在1 mT暴露條件下共有84個差異表達(dá)基因（其中包括44個基因上調(diào)，40個基因顯著下調(diào)）；在3 mT暴露條件下，差異表達(dá)的基因共有324個，其中包括235上調(diào)的基因和89個下調(diào)的基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)50 Hz ELF-EMF暴露下，Maoa、Bh

11、mt、Gng8、Ugt2b34、Dgat1和Adh1等基因可能是1 mT暴露條件下關(guān)鍵應(yīng)答靶基因；而Cyp3a11、Ugt2b34、Adcy5、Ptgs1和Cyp2b23等基因是3 mT暴露條件下核心的靶基因。通過對相關(guān)基因表達(dá)驗證結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵性差異表達(dá)的基因主要涉及到免疫應(yīng)激、組蛋白修飾、氧化應(yīng)激等信號通路，提示50 Hz ELF-EMF可能影響相關(guān)的信號通路而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，為后續(xù)的深入研究提供了研究資料。

12、>　?、萃ㄟ^miRNA表達(dá)譜芯片建立了50 Hz ELF-EMF暴露條件下差異miRNA表達(dá)譜。結(jié)果表明：50 Hz ELF-EMF暴露可以明顯誘導(dǎo)miRNA差異表達(dá)。1 mT暴露組共有19個 miRNA的表達(dá)發(fā)生改變，其中有7個 miRNA表達(dá)上調(diào)，12個miRNA表達(dá)下調(diào)。在3 mT暴露組，差異表達(dá)的miRNA共有36個，其中有9個miRNA表達(dá)上調(diào)，27個miRNA表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在1 mT暴露組中， miR-211-3

13、p、miR-494-3p、miR-669f-3p和miR-1907是關(guān)鍵性應(yīng)答miRNA。然而，在3 mT暴露組，miR-30e-5p、miR-210-5p、miR-224-5p、miR-196b-5p、miR-504-3p、miR-669c-5p和miR-455-3p是關(guān)鍵性應(yīng)答miRNA。這些差異表達(dá)miRNA可能與ELF-EMF的生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)。采用GO和KEGG對miRNA靶基因所涉及的信號通路分析發(fā)現(xiàn)，相關(guān)的miRNA靶基

14、因主要參與mTOR信號通路、晝夜節(jié)律信號通路、p53信號通路、長期抑郁和 MAPK信號通路等信號通路，提示50 Hz ELF-EMF可能通過 miRNA影響上述信號通路和相關(guān)的生物學(xué)功能。我們的研究也表明這些顯著改變的miRNA可作為候選的生物標(biāo)志物。
　?、奘状伟l(fā)現(xiàn)不同場強(qiáng)的50 Hz ELF-EMF能夠改變 GC-2細(xì)胞中miR-26b-5p的表達(dá)水平。單獨過表達(dá)或者沉默 miR-26b-5p對 GC-2細(xì)胞的生長、凋亡以及細(xì)

15、胞周期沒有明顯影響。但是過表達(dá)miR-26b-5p再暴露于3 mT50 Hz ELF-EMF會引起GC-2細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，提示miR-26b-5p與50 Hz ELF-EMF存在著明顯的交互作用。進(jìn)一步的機(jī)制分析表明，CCND2是miR-26b-5p的一個直接的靶基因，miR-26b-5p的表達(dá)與CCND2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步的實驗表明50 Hz ELF-EMF與miR-26b-5p表達(dá)都可以改變CCND2 mRNA和蛋

16、白的表達(dá)水平從而影響細(xì)胞周期。相關(guān)研究首次表明miR-26b-5p-CCND2在GC-2細(xì)胞暴露于50 Hz ELF-EMF過程中對細(xì)胞周期的調(diào)控發(fā)揮重要作用。
　　（2）1800 MHz RF-EMF的表觀遺傳學(xué)研究
　?、僖圆煌任章剩? W/kg、2 W/kg和4 W/kg），間歇式暴露模式（5 min開10 min關(guān)）分別建立了1800 MHz RF-EMF暴露條件下小鼠GC-2細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)細(xì)胞研究模型。暴露7

17、2 h后采用CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)等方法分析發(fā)現(xiàn)：不同比吸收率的1800 MHz RF-EMF暴露對GC-2細(xì)胞的形態(tài)、生長沒有明顯的影響。不同比吸收率的1800 MHz RF-EMF對GC-2細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡也沒有明顯的影響。
　?、诓捎肈ot blot方法分析1800 MHz RF-EMF暴露后GC-2細(xì)胞全基因組甲基化水平，分析結(jié)果表明1 W/kg和2 W/kg RF-EMF暴露時全基因組甲基化水平無明顯變化，而4 W/

18、kg RF-EMF暴露條件下GC-2細(xì)胞全基因組甲基化水平升高。進(jìn)一步的機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)1800 MHz RF-EMF可改變DNMTs mRNA和蛋白水平的表達(dá)。表明4 W/kg RF-EMF暴露能導(dǎo)致GC-2細(xì)胞DNA甲基化異常改變，且DNMTs參與了4 W/kg RF-EMF誘導(dǎo)的全基因組甲基化水平改變調(diào)控。
　?、劾?DNA甲基化芯片對差異甲基化調(diào)控基因進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)4 W/kg RF-EMF暴露條件下，共有132個差異甲基

19、化位點（54高甲基化和78低甲基化）。深入分析發(fā)現(xiàn)Cycs、Xpnpep3、Nmur2和Mob1a等基因的甲基化改變較為明顯，且負(fù)調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，提示我們DNA甲基化可能參與了1800 MHz RF-EMF的生物效應(yīng)過程。
　?、芡ㄟ^miRNA表達(dá)譜芯片建立了1800 MHz RF-EMF暴露條件下差異miRNA表達(dá)譜。分析結(jié)果表明4 W/kg RF-EMF暴露可以誘導(dǎo) miRNA差異表達(dá)。通過qRT-PCR驗證和生物信息學(xué)分

20、析發(fā)現(xiàn)，miR-19a-3p、miR-291b-5p、miR-7684-5p、miR-6958-3p、miR-344g-5p、miR-669n和miR-1896可能是4 W/kg RF-EMF暴露條件下主要應(yīng)答miRNA。這些差異表達(dá)miRNA可能與4 W/kg RF-EMF的生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)。
　　⑤通過表達(dá)譜芯片建立了4 W/kg RF-EMF暴露后全基因組表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)共511差異表達(dá)基因，其中255個基因表達(dá)上調(diào)，256個

21、基因表達(dá)下調(diào)。Signal-Net分析發(fā)現(xiàn)Ugt2a1和Cyp2b10可能是重要的靶基因。通過進(jìn)一步驗證和信號通路分析發(fā)現(xiàn)，4 W/kg RF-EMF暴露條件下主要影響天然免疫反應(yīng)、β干擾素細(xì)胞反應(yīng)、嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)活性的配體-受體之間的相互作用、G蛋白偶聯(lián)受體等信號通路，提示RF-EMF暴露對一些基本生命活動有一定的影響。
　　⑥進(jìn)一步對1800 MHz RF-EMF作用機(jī)制進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 W/kg RF-EMF暴露后

22、與天然免疫反應(yīng)有關(guān)的基因，包括IL1а、IL6、IL10、Psg19、Oas1g和Cxcl10表達(dá)水平改變明顯；與嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因，包括Olfr50、Olfr128、Olfr167等基因的表達(dá)水平也發(fā)生了顯著的改變，表明免疫反應(yīng)和嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路可能在4 W/kg1800 MHz RF-EMF的生物效發(fā)揮著重要的作用，具有進(jìn)一步深入研究的必要。
　　綜上所述，本實驗結(jié)果表明50 Hz ELF-EMF和1800 MHz R