成骨細胞在介導(dǎo)乳腺癌細胞增殖及表達骨擬態(tài)中的作用.pdf

1、目的:
　　乳腺癌目前是女性患者第一好發(fā)的腫瘤，雖然早期診斷其治療效果好，但是一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移后其預(yù)后效果比較差。骨是乳腺癌細胞最容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位，乳腺癌轉(zhuǎn)移至骨后會并發(fā)諸如高鈣血癥、病理性骨折、神經(jīng)及脊髓的壓迫等，嚴(yán)重的影響患者的生存質(zhì)量及時間。有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移至骨的乳腺癌細胞會發(fā)生骨擬態(tài)的改變，即在骨轉(zhuǎn)移灶中乳腺癌細胞會模擬成骨細胞的表型，并且能夠分泌成骨細胞所特異分泌的蛋白及因子。這種特性可以讓轉(zhuǎn)移至骨的腫瘤細胞去逃避免疫系統(tǒng)的

2、識別使其在骨微環(huán)境中快速的增殖，腫瘤細胞的這種特性可能成為研究腫瘤骨轉(zhuǎn)移的新突破口。腫瘤細胞在骨轉(zhuǎn)移灶中把自己偽裝成成骨細胞，那么成骨細胞在腫瘤細胞骨擬態(tài)中起到了什么樣的作用，目前尚不清楚。
　　成骨細胞能夠特異性分泌骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)，而這幾種特異性蛋白均在腫瘤細胞骨轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。目前已經(jīng)證實OCN的

3、表達在乳腺癌患者的血清中明顯增高，OPG的表達與腫瘤細胞的克隆及歸巢密切相關(guān)，OPN的表達量增高有利于腫瘤細胞的增殖及侵襲。有學(xué)者將成骨細胞與前列腺癌細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)前列腺癌細胞能夠發(fā)生骨擬態(tài)的改變。本實驗第一部分假設(shè)如果轉(zhuǎn)移至骨的腫瘤細胞的骨擬態(tài)是由成骨細胞引起的，那么成骨細胞也能夠促使溶骨型的乳腺癌細胞發(fā)生骨擬態(tài)的改變并且能夠高表達OPN、OPG、OCN等成骨細胞骨特異性分泌且與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及增殖密切相關(guān)的蛋白。其次，眾所周知，腫瘤

4、細胞在骨微環(huán)境中的生長與骨質(zhì)破壞后釋放的腫瘤生長因子息息相關(guān)，但有研究表明，雙磷酸鹽能夠通過抑制破骨細胞分化、成熟，從而很好的抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶的骨質(zhì)破壞并間接的影響腫瘤生長因子的釋放，但是卻不能抑制腫瘤的生長，這說明除了骨質(zhì)破壞后釋放的大量生長因子刺激腫瘤細胞增殖外，腫瘤細胞一定有其它的增殖途徑。
　　本課題通過將成骨細胞與溶骨型乳腺癌細胞共培養(yǎng)，研究成骨細胞在乳腺癌細胞發(fā)生骨擬態(tài)以及腫瘤細胞增殖中的作用。為深入研究腫瘤細胞骨擬

5、態(tài)及增殖的機制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.通過transwell小室建立成骨細胞MC3T3-E1與乳腺癌MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)體系，模擬骨微環(huán)境。通過實時免疫熒光定量PCR及蛋白免疫印跡實驗檢測共培養(yǎng)后的MDA-MB-231細胞成骨相關(guān)基因及蛋白OCN、OPN、OPG的表達量，并與未共培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞相比，以此確定乳腺癌MDA-MB-231細胞是否發(fā)生了骨擬態(tài)的改變。
　　2.通過結(jié)晶紫染色法

6、觀察與成骨細胞MC3T3-E1共培養(yǎng)后的乳腺癌細胞在集落形成速度及大小上與未和成骨前體細胞MC3T3-E1共培養(yǎng)的差別。
　　3.通過CCK-8檢測與成骨前體細胞MC3T3-E1共培養(yǎng)后的MDA-MB-231乳腺癌細胞與親代MDA-MB-231細胞在細胞增殖方面的差異。
　　4.通過PCR檢測與成骨細胞共培養(yǎng)后的乳腺癌細胞Wnt-1及Wnt-2的基因表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.將與MC3T3-E1成骨前體細胞

7、共培養(yǎng)后的實驗組MDA-MB-231乳腺癌細胞與未和MC3T3-E1成骨前體細胞共培養(yǎng)的對照組相比，實驗組中OCN、OPN、OPG的mRNA及蛋白表達明顯的高于對照組(p＜0.05)。
　　2.通過結(jié)晶紫染色法將與MC3T3-E1成骨前體細胞共培養(yǎng)后的實驗組MDA-MB-231乳腺癌細胞與未和MC3T3-E1成骨前體細胞共培養(yǎng)的對照組相比，實驗組在集落形成數(shù)量及大小上明顯優(yōu)于對照組(p＜0.05)。
　　3.CCK-8實驗表

8、明在0及24h時實驗組與對照組的細胞增殖差異不明顯，但在48及72h時實驗組的細胞增殖能力較對照組有明顯的提高。
　　4.PCR結(jié)果提示，與成骨前體細胞共培養(yǎng)后的實驗組MDA-MB-231乳腺癌細胞與未和MC3T3-E1成骨前體細胞共培養(yǎng)的對照組相比，實驗組乳腺癌細胞的Wnt-1及Wnt-2的mRNA表達明顯上調(diào)(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成骨細胞MC3T3-E1可誘導(dǎo)溶骨型乳腺癌MDA-MB-231細胞發(fā)