LOX相互作用蛋白的驗(yàn)證及其在乳腺癌遷移與侵襲中的研究.pdf

1、目的：
　　1．賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）的相互作用蛋白的驗(yàn)證，明確蛋白相互作用位點(diǎn)。
　　2．探討LOX和XRCC5蛋白相互作用對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響。
　　方法：
　　1．在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組蛋白LOX-SF的慢病毒，通過(guò)western blot和RT-PCR對(duì)細(xì)胞中重組蛋白LOX-SF進(jìn)行檢測(cè)。
　　2．采用雙向免疫共沉淀，免疫熒光共定位的實(shí)驗(yàn)方法

2、驗(yàn)證LOX與XRCC5和Histone H1.1的相互作用。
　　3.我們采用慢病毒作為載體的過(guò)表達(dá)技術(shù),分別構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LOX、過(guò)表達(dá)XRCC5的載體,單獨(dú)轉(zhuǎn)染和聯(lián)合轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移潛能并且LOX低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中，分為未轉(zhuǎn)染組、LOX空載體組、LOX轉(zhuǎn)染組、XRCC5空載體組，XRCC5轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組；流式分選聯(lián)合轉(zhuǎn)染LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)載體及空載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)

3、胞株，western blot和RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的LOX和XRCC5蛋白表達(dá)的變化，分別通過(guò)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移與侵襲能力。
　　結(jié)果：
　　1.在MOI=10的條件下，LOX慢病毒轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231細(xì)胞，96 h后鏡下觀察綠色熒光間接評(píng)估慢病毒轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染效率＞90％。Western blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組能檢測(cè)到重組蛋白LOX-SF和LOX本體蛋白，而空白

4、對(duì)照組和陰性對(duì)照組未能檢測(cè)到重組蛋白LOX-SF的條帶，僅都能檢測(cè)到LOX本體蛋白。RT-PCR結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組、空載對(duì)照組及空白對(duì)照組重組基因LOX mRNA的2-ΔΔCt值分別為15.32±0.12、1.18±0.01、1.00±0.00，實(shí)驗(yàn)組LOX-SF mRNA表達(dá)水平明顯高于空載對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.01），空載對(duì)照組和空白對(duì)照組LOX-SF mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　2．免疫共沉淀（Co-I

5、P）結(jié)果表明，Western blot能檢測(cè)到LOX抗體沉淀的免疫復(fù)合物中含有XRCC5、Histone H1.1蛋白,且免疫印跡中出現(xiàn)的條帶與MDA-MB-231細(xì)胞總蛋白的條帶位置一致。
　　3.反向免疫共沉淀結(jié)果表明： Western blot能分別檢測(cè)到XRCC5抗體、Histone H1.1抗體沉淀的免疫復(fù)合物中含有LOX蛋白,且免疫印跡中出現(xiàn)的條帶與MDA-MB-231細(xì)胞總蛋白中的LOX蛋白條帶位置一致。
　　

6、4.實(shí)驗(yàn)采取內(nèi)源性共定位分析（即未經(jīng)任何處理的MDA-MB-231細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞）進(jìn)行。分別用不同種屬的抗體進(jìn)行免疫熒光定位分析，用激光共聚焦顯微鏡掃描(630×)可見(jiàn)，LOX與Histone H1.1共定位分析： LOX紅光標(biāo)記，主要定位在胞質(zhì)，少部分在胞核，呈彌散分布；Histone H1.1綠光標(biāo)記，主要定位在胞質(zhì)，LOX與Histone H1.1在胞質(zhì)存在明顯共定位，呈現(xiàn)黃色。LOX與XRCC5共定位分析：LOX綠光標(biāo)記，

7、主要定位在胞質(zhì)及細(xì)胞核，呈彌散分6．采用Western blot及Real-time PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組LOX和XRCC5在基因和蛋白水平的變化。Western blot結(jié)果能檢測(cè)到LOX蛋白在MCF-7有表達(dá)且為低表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組能檢測(cè)到重組蛋白LOX-SF和LOX本體蛋白，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組未能檢測(cè)到重組蛋白LOX-SF的條帶，僅都能檢測(cè)到LOX本體蛋白。與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較，XRCC5過(guò)表達(dá)組的XRCC5蛋白表達(dá)明顯升

8、高。與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞LOX和XRCC5蛋白表達(dá)量均明顯升高。Real-time PCR結(jié)果顯示：LOX過(guò)表達(dá)組、LOX空載體組、LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA的2-ΔΔCt值分別為241.04±45.81、2.86±0.41、207.12±23.40、2.06±0.06、1.00±0.00，LO X過(guò)表達(dá)組、LOX和XRCC

9、5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA表達(dá)水平明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組（P＜0.01），空載體組和未轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。XRCC5過(guò)表達(dá)組、XRCC5空載體組、LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的XRCC5 mRNA的2-ΔΔCt值分布；XRCC5紅光標(biāo)記，定位在細(xì)胞核內(nèi)，也呈彌散分布；LOX和XRCC5在細(xì)胞核存在明顯的共定位，呈現(xiàn)黃色。
　　5．在

10、MOI=10條件下，將LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)慢病毒載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，對(duì)LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組及LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞進(jìn)行流式熒光分選，通過(guò)流式熒光檢測(cè)LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組篩選出的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率由15.37%提高到83.94%，LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞流式熒光檢測(cè)，轉(zhuǎn)染效率由45.65%提高到70.82%。
　　6．采用Western blot及Real-time

11、PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組LOX和XRCC5在基因和蛋白水平的變化。Western blot結(jié)果能檢測(cè)到LOX蛋白在MCF-7有表達(dá)且為低表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組能檢測(cè)到重組蛋白LOX-SF和LOX本體蛋白，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組未能檢測(cè)到重組蛋白LOX-SF的條帶，僅都能檢測(cè)到LOX本體蛋白。與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較，XRCC5過(guò)表達(dá)組的XRCC5蛋白表達(dá)明顯升高。與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞LOX和XRCC

12、5蛋白表達(dá)量均明顯升高。Real-time PCR結(jié)果顯示：LOX過(guò)表達(dá)組、LOX空載體組、LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA的2-ΔΔCt值分別為241.04±45.81、2.86±0.41、207.12±23.40、2.06±0.06、1.00±0.00，LO X過(guò)表達(dá)組、LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA表達(dá)水平明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組（P＜0.01），

13、空載體組和未轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。XRCC5過(guò)表達(dá)組、XRCC5空載體組、LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組、LOX和XRCC5空載體共轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的XRCC5 mRNA的2-ΔΔCt值分別為6.57±0.85、1.10±0.27、4.29±0.05、0.76±0.15、1.00±0.00。XRCC5過(guò)表達(dá)組、LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組的XRCC5 mRNA表達(dá)水平明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組

14、（P＜0.05），空載體組和未轉(zhuǎn)染組的XRCC5 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　7．Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察遷移細(xì)胞數(shù)目，相對(duì)于空載體組（71.67±3.51），LOX過(guò)表達(dá)組(358.67±18.58)、XRCC5過(guò)表達(dá)組(200.67±11.02)及LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組（513.33±15.28）的細(xì)胞遷移能力均明顯增強(qiáng)（P<0.05）。LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)最多，與單

15、獨(dú)轉(zhuǎn)染組即LOX過(guò)表達(dá)組和XRCC5過(guò)表達(dá)組比較，差異顯著（P<0.05），細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。
　　8. Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察侵襲細(xì)胞數(shù)目，LOX過(guò)表達(dá)組(97.00±7.55)、XRCC5過(guò)表達(dá)組(74.33±6.66)及LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組（140.00±24.98）的細(xì)胞侵襲能力均比空載體組（14.67±4.73）的明顯增強(qiáng)（P<0.05），且LOX和XRCC5過(guò)表達(dá)共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的侵襲能力明顯強(qiáng)于

16、LOX過(guò)表達(dá)組和XRCC5過(guò)表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.LOX與XRCC5存在直接或間接相互作用。
　　2. LOX與Histone H1.1存在直接或間接相互作用。
　　3.在MCF-7細(xì)胞中，上調(diào)LOX和XRCC5的表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移、侵襲能力，且兩者的聯(lián)合轉(zhuǎn)染能進(jìn)一步促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力。LOX和XRCC5相互作用可能協(xié)同促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。