MEF2D對DYRK1A基因表達的調節(jié).pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 MEF2D對DYRK1A的轉錄調控
　　研究目的：
　　研究DYRK1A不同異構體在神經(jīng)膠質瘤細胞系中的特異性表達情況，以及MEF2D對DYRK1A不同異構體的轉錄調控，明確其分子調控機制，并進一步探索MEF2D對DYRK1A的調控作用與神經(jīng)發(fā)育之間的關系。
　　研究方法：
　　1.在人腦膠質瘤T98G細胞系中研究轉錄因子MEF2D對DYRK1A基因不同異構體的

2、轉錄調控。應用LipofectamineTM2000分別將MEF2D表達質粒pCMV6-entry-MEF2D及空白對照質粒轉染入T98G細胞，48小時后將細胞收集起來，應用TRIzol法提取細胞中的RNA，并使用Takara PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA，進一步通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測內源性DYRK1A mRNA不同異構體的表達變化;應用SYBR Green法實時熒光定量PCR

3、(Real-time RT-PCR)法再次檢測DYRK1A不同異構體的表達情況并進行分析。
　　2.MEF2D對DYRK1A啟動子活性調控。
　　2.1 DYRK1A啟動子質粒的構建:利用PCR技術從提取的人類基因組中擴增DYRK1A的啟動子序列，并將其克隆到無啟動子活性的pGL3-Basic載體中，或者啟動子質粒pDYluc-long;
　　2.2 MEF2D高表達及敲除siRNA效果檢測。應用Lipofectami

4、neTM2000將MEF2D表達質粒及敲除siRNA分別與空白對照轉染入T98G細胞，轉染后48小時收集細胞并裂解，蛋白定量后應用Western Blot檢測MEF2D以及DYRK1A的表達變化，β-ACTIN作為內參;
　　2.3 應用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D及空白對照質粒、MEF2D敲除siRNA及空白對照分別與pDYluc-long及pGL3-Basic質粒轉染入HEK293

5、細胞，48小時后裂解細胞并應用Luciferase Assay技術檢測啟動子活性。
　　3.尋找并確認DYRK1A啟動子功能性DY-MRE(MEF2D responsiveelement)位點。
　　3.1 MEF2D結合位點預測:http://jaspar.genereg.net/網(wǎng)站中輸入DYRK1A啟動子區(qū)序列，預測MEF2D的可能結合位點;
　　3.2 分別構建含有DYRK1A啟動子不同區(qū)域截短體的熒光素酶載體

6、，應用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D及空白對照質粒分別與不同截短體載體及pGL3-Basic質粒共轉染HEK293細胞，48小時候收集細胞并裂解，應用Luciferase Assay分析不同截短體在MEF2D作用下的啟動子活性變化;
　　3.3 構建包含預測DY-MRE的載體及對應的突變載體，轉染HEK293細胞并通過Luciferase Assay再次確認MRE的活性。
　　4.

7、在動物模型中研究MEF2D與DYRK1A之間的關系。分別取胚胎期為13.5天(E13.5)、18天(E18)及出生后1、7、14天(P0，P7，P14)的多只小鼠的大腦皮層，應用TRIzol法提取組織中的RNA，進一步應用TakaraPrimeScriptTM反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，結合SYBR Green法實時熒光定量檢測樣本中MEF2D及總DYRK1A的mRNA表達情況。
　　研究結果：
　　1.MEF2D

8、可以特異性上調DYRK1A的mRNA總量DYRK1A isoform5的表達量，對DYRK1A isoform2，3的mRNA表達量并無影響。T98G以及HEK293細胞中可以檢測到DYRK1A isoform1和5以及MEF2D的蛋白表達。
　　2.MEF2D通過增強DYRK1A isoform5的啟動子活性上調DYRK1A mRNA的表達。
　　2.1 MEF2D高表達后顯著上調DYRK1A啟動子活性;
　　2.2

9、 MEF2D被敲減后，DYRK1A啟動子活性與對照相比顯著降低。
　　3.DYRK1A基因啟動子上MEF2D功能性位點DY-MRE的確定。
　　3.1 通過Jaspar網(wǎng)站對DYRK1A啟動子區(qū)域序列進行分析，獲得可能的MEF2D結合位點;
　　3.2 雙熒光素酶報告基因檢測方法檢測DYRK1A啟動子不同區(qū)截短體質粒在MEF2D高表達時啟動子活性的變化。結果發(fā)現(xiàn)包含-442～-254 bp位點的啟動子活性可以被MEF2

10、D上調，通過Jaspar序列分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域包含一個可能的功能性MEF2D結合位點，位于-268～-254 bp;
　　3.3 分別構建包含-268～-254 bp及對應突變的啟動子載體，結合雙熒光素酶報告基因檢測方法證實該段區(qū)域啟動子活性可被MEF2D特異性上調，關鍵堿基突變后，MEF2D對啟動子活性的上調作用消失。
　　4.DYRK1A與MEF2D在正常小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育過程中mRNA表達呈正相關性。當MEF2D表達較高時

11、，DYRK1A表達水平也相應較高，而當MEF2D表達量較低時，DYRK1A的表達量隨之降低，通過斯皮爾曼相關系數(shù)計算證實p=0.0478，r=0.6182。結果提示MEF2D與DYRK1A在大腦的神經(jīng)發(fā)育過程中可能存在協(xié)同作用。
　　研究結論：
　　1.MEF2D可以特異性上調人DYRK1A isoform5的轉錄。
　　2.人DYRK1A基因啟動子活性可被MEF2D上調，-268～-254 bp處的DYMRE位點可與

12、MEF2D特異性結合，激活DYRK1A的啟動子活性。
　　3.MEF2D與DYRK1A在正常小鼠的大腦皮層神經(jīng)發(fā)育過程中，mRNA的表達量呈正相關性。
　　4.在神經(jīng)膠質瘤細胞系中，MEF2D通過特異性上調DYRK1A的表達降低NFATc2的蛋白表達量。
　　第二部分 DYRK1A對MEF2D的磷酸化修飾及功能影響
　　研究目的：
　　研究雙底物特異性酪氨酸磷酸化調節(jié)激酶A(DYRK1A)對轉錄因子MEF2

13、D的磷酸化修飾，探尋修飾位點及作用機制，明確MEF2D磷酸化修飾對其功能的影響。
　　研究方法：
　　1.在人胚腎HEK293細胞研究DYRK1A對MEF2D的磷酸化作用。應用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D表達質粒分別與pCMV6-entry-DYRK1A表達質粒及空白對照質粒共轉染入HEK293細胞，轉染后48小時收集并裂解細胞，應用Western Blot檢測MEF2D的表達情

14、況。
　　2.通過質譜檢測，尋找并分析MEF2D蛋白被DYRK1A磷酸化的位點。
　　2.1 構建MEF2D的原核表達載體。MEF2D表達序列全長521個氨基酸，將其克隆入pET32a(+)載體中，得到pET32a-MEF2D質粒，測序驗證其正確表達;
　　2.2 將構建好的pET32a-MEF2D轉化入感受態(tài)BL21細胞中進行原核擴增，并應用適當濃度的IPTG過夜誘導，收集菌體并進行過Ni-NTA柱純化;
　　

15、2.3 對純化后的蛋白進行BCA法蛋白定量，并應用Western Blotting進行檢測，驗證其原核表達的正確性。
　　3.DYRK1A對MEF2D蛋白轉錄活性的影響。
　　3.1 將MEF2D特異性識別位點的多拷貝序列(MRE)插入pGL3-Basic載體中，構建p3×MRE載體;
　　3.2 應用LipofectamineTM2000將DYRK1A表達載體、DYRK1A激酶失活載體DYRK1A(K188R)及空白

16、對照分別與pGL3-Basic和p3×MRE載體轉染入HEK293細胞中;
　　3.3 轉染48小時后收集樣品進行Luciferase Assay檢測，并分析檢測結果。
　　研究結果：
　　1.DYRK1A過量表達可以顯著升高外源MEF2D的表達水平，并使蛋白分子量發(fā)生改變，提示存在化學修飾。
　　2.純化MEF2D重組蛋白后進行體外磷酸化反應結合質譜分析結果顯示，與空白對照相比，被DYRK1A處理過的MEF2D

17、蛋白樣品，位于251位的絲氨酸存在磷酸化修飾。
　　3.Luciferase Assay結果顯示，與pGL3-Basic相比，MEF2D可以顯著性升高p3×MRE載體的活性，但DYRK1A會使p3×MRE的活性降低，而失去激酶活性的DYRK1A不會使p3×MRE的活性降低。
　　4.被DYRK1A磷酸化的MEF2D，在NH4Cl的作用下，降解速率顯著降低。
　　研究結論：
　　1.DYRK1A升高MEF2D的表達