轉錄因子Spt6的串聯SH2結構域識別RNA聚合酶IIC-端結構域磷酸化修飾的結構生物學研究.pdf

1、RNA聚合酶II(RNAP II)負責了真核細胞中mRNA、microRNA和大多數的snRNA的轉錄。在轉錄過程中有大量的轉錄因子(transcription factors)參與調節(jié)轉錄的各個階段，RNAPII的C-末端結構域(CTD)是眾多轉錄因子結合的重要區(qū)域。RNAPII CTD是由幾十個(26至52)YSPTSPS氨基酸序列重復構成，而且它的磷酸化修飾與轉錄調節(jié)密切相關。其主要磷酸化位點Ser2和Ser5在mRNA轉錄周期中

2、動態(tài)變化，在不同時期招募了各種調節(jié)因子，比如Spt6就是在轉錄延伸階段被Ser2位磷酸化所招募的延伸因子。
　　 Spt6是組蛋白H3:H4的分子伴侶，參與轉錄后染色質重組裝(re-assembly)的，它的功能缺失會導致從基因編碼區(qū)內部隱含啟動子(cryptic promoter)的轉錄起始，以及mRNA處理和出核轉運的功能障礙。Spt6行使其轉錄調節(jié)功能依賴于它和RNAPII CTD的結合，它通過一個非典型的SH2結構域識別

3、了CTD的Ser2磷酸化(Ser2P)；這是第一個被證實能夠結合磷酸化絲氨酸而不是磷酸化酪氨酸的SH2結構域，而且它是釀酒酵母中發(fā)現的唯一SH2結構域，在進化上可能代表了SH2家族的起源；因此，從分子結構水平闡釋它的識別機理和分子進化地位具有重要的意義。本研究報道了Spt6蛋白質中一個全新的SH2結構域，它與已報道的SH2結構域域組成一個串聯結構域模塊。我們用溶液核磁共振技術和X射線晶體衍射解析了釀酒酵母和人類Spt6串聯SH2的結構域

4、的三維結構，研究了串聯SH2結構域模塊與RNAPII CTD的結合。
　　 第1章中簡略地回顧了RNAPII轉錄的調節(jié)，特別是CTD磷酸化在其中所扮演的角色；同時綜述了Spt6蛋白質的相關研究進展，重點介紹了其SH2結構域的相互作用和功能。
　　 第2章詳細描述了釀酒酵母Spt6蛋白質串聯SH2結構域的結構與功能研究。通過異核多維核磁共振，我們解析了它在溶液中的三維結構；發(fā)現兩個串聯的SH2結構域形成一個棒狀的整體結構，

5、兩個結構域之間存在一個保守的疏水核心；主鏈酰胺基團的縱向、橫向弛豫時間(T1、T2)和異核[15N-1H]-NOE數據表明兩個SH2結構域與結構域之間的連接區(qū)域都具有一樣的動力學性質，同時殘留偶極耦合(RDC)數據的分析也表明兩個SH2結構域在溶液中具有相同的取向(orientation)?；瘜W位移擾動實驗證明串聯SH2結構域可以結合多種磷酸化狀態(tài)的CTD多肽，包括Ser2P、Ser5P、Ser2PSer5P和Tyr1P，而且磷酸化多肽

6、的結合位點都位于第一個SH2結構域(SH2N)的同一區(qū)域中，而第二個結構域(SH2C)則沒有直接參與相互作用。GST pull-down實驗也表明Spt6的串聯SH2結構域可以和細胞裂解液中的RNAPII結合。我們從結構上分析了SH2N既能結合磷酸化絲氨酸，又能結合磷酸化酪氨酸的分子機制。SH2C的分子進化分析表明它是一類新的SH2結構域亞家族，而且和SH2N形成一個保守的且不可分割的結構模塊，存在而且只存在于真核生物Spt6蛋白質中。

7、
　　 第3章敘述了人類Spt6蛋白質串聯SH2結構域的X射線晶體學研究。我們用蛋白質單晶收集了X射線衍射數據，進一步用硒代晶體的單波長反常散射(MAD)獲得了相位信息，解析了2.3 ?的晶體結構。結構表明人類Spt6串聯SH2結構域與釀酒酵母有所不同，它的第一個結構域SH2N的bE-bF區(qū)域發(fā)生了結構域交換(domain-swapping)，形成同二聚；但是同一個單體分子的兩個串聯SH2結構域的相對取向和堆積與釀酒酵母一樣，表

8、明這是一個結構保守的模塊。凝膠過濾、分析型超速離心實驗和共表達實驗表明在溶液中人類串聯SH2結構域確實主要以二體形成存在。GST pull-down實驗同樣表明人類Spt6的串聯SH2結構域可以結合細胞裂解液中的RNAP II。
　　 第4章描述了RNAPII CTD及其Ser2位點的激酶pTEFb復合物的表達純化。同過共表達，我們用大腸桿菌成功表達了人類Cdk9(2-330)和cyclin T1(1-272)片段的復合物。另外

9、我們嘗試了自行表達釀酒酵母和人類RNAPII的CTD片段，但是沒有成功，后來從其他研究組索取了小鼠CTD的表達質粒，獲得了CTD重組蛋白質。
　　 在本研究中，我們用不同方法解析了釀酒酵母和人類Spt6的串聯SH2結構域的三維結構，發(fā)現了一個存在于Spt6蛋白質中新的SH2亞家族；滴定實驗還發(fā)現SH2N不僅結合磷酸化絲氨酸，也結合磷酸化酪氨酸，分子的三維結構很好的解釋了它的底物多樣性，同時它與不同底物的親和力也很好的支持了Spt