透明顫菌血紅蛋白基因在弗氏鏈霉菌中的克隆與表達.pdf

1、弗氏鏈霉菌是泰樂菌素的產(chǎn)生菌,它嚴格好氧,其發(fā)酵液由于較粘稠而導致溶氧較差,因此溶氧成為泰樂菌素產(chǎn)量提高的限制性因素之一.該研究旨在通過在弗氏鏈霉菌中表達透明顫菌血紅蛋白基因(vhb)來改善氧的傳遞,進而改善菌體生長,提高泰樂菌素的產(chǎn)量.pIJ8600是能整合于鏈霉菌染色體的表達載體,其含有鏈霉菌噬菌體oC31整合性位點,并擁有能被硫鏈絲菌素誘導的強啟動子(P<,tipA>).將vhb基因置于P<,tipA>之下,構建成vhb基因表達載

2、體pWQ2005,通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉移導入弗氏鏈霉菌中,PCR驗證表明vhb基因成功整合到染色體上,經(jīng)硫鏈絲菌素誘導后,CO結合差光譜分析顯示,pWQ2005表達出有生物活性的VHb蛋白.搖瓶發(fā)酵實驗初步證實,VHb蛋白的表達可明顯促進泰樂菌素的合成與菌體的生長,但不同誘導時間產(chǎn)生的作用效果差異顯著.pSET152與pIJ8600屬同一類型的載體,但其不含用以表達外源基因的啟動子;該研究利用其構建成含自身啟動子的vhb基因表

3、達載體pWQ1116,但vhb基因在限氧條件下卻未在弗氏鏈霉菌中表達,這可能是弗氏鏈霉菌的RNA聚合酶不能識別該啟動子.紅霉素抗性基因啟動子(P<,ermE>)是能在鏈霉菌中組成型表達的強啟動子.應用SOE-PCR(Splicing of Overlap Extension by PCr)將不含自身啟動子的vhb基因置于P<,ermE>之下,利用P<,ermE>表達vhb基因.為使vhb基因在弗氏鏈霉菌中更好的表達,對其進行了定點誘變,

4、構建成經(jīng)誘變的vhb基因表達載體pWQ2004和pWQ1023,并構建成未誘變的vhb基因表達載體pWQ1118作對照;CO結合差光譜分析顯示,三者在弗氏鏈霉菌中均表達出有生物活性的透明顫菌血紅蛋白(VHb),但與對照相比,經(jīng)誘變的vhb基因表達量有所提高.候選接合子(Streptomyces fradiae/p WQ2004)經(jīng)初篩后,進行的搖瓶與5L罐發(fā)酵結果初步顯示,VHb蛋白的表達顯著促進泰樂菌素合成與菌體的生長,這種作用越是在