巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響.pdf

1、目的：
　　細(xì)胞表面糖基化的改變是腫瘤的特征之一，糖鏈的改變影響著糖蛋白的生物功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間相互作用的改變，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)是形成核心巖藻糖修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶，在乳腺癌中有異常的表達(dá)，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。本課題采用RNA干擾技術(shù)，將靶向針對(duì)FUT8的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)乳腺癌細(xì)胞，觀(guān)察FUT8干擾對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，探討FUT8在乳腺癌發(fā)

2、生發(fā)展中的作用機(jī)制，為乳腺癌分子靶向治療和診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231中9種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶亞型mRNA的表達(dá)，篩選在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶亞型。
　　2、利用轉(zhuǎn)染試劑Lip2000將構(gòu)建好的人FUT8基因重組真核質(zhì)粒pGPU/GFP/Neo-FUT8及對(duì)照載體轉(zhuǎn)入人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、M

3、DA-MB-231中，利用G418篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞。
　　3、Quantitative Real-Time PCR及Western Blot方法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中FUT8基因和蛋白的表達(dá)鑒定RNA干擾的效果。
　　4、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FUT8干擾對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。
　　5、Quantitative Real-Time PCR及Western Blot方法檢測(cè)粘附分子E-cadherin、β-c

4、atenin和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9基因和蛋白水平表達(dá)的變化。
　　6、激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)β-catenin在細(xì)胞核、細(xì)胞膜分布的變化。
　　7、CCK8檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，QuantitativeReal-Time PCR檢測(cè)細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2及細(xì)胞周期蛋白cyclinD1基因水平的變化;Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)的改變，觀(guān)察FUT8低表達(dá)對(duì)乳腺癌

5、細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1、Quantitative Real-Time PCR和Western Blot結(jié)果表明FUT8-shRNA轉(zhuǎn)染組，F(xiàn)UT8基因和蛋白的表達(dá)水平均降低。
　　2、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FUT8低表達(dá)細(xì)胞株遷移能力降低。
　　3、E-cadherin在MCF-7中和MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著升高，而β-cateni

6、n表達(dá)量則變化不大，但E-cadherin/β-catenin表達(dá)總量在兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中是升高的;MMP2和MMP9在兩種細(xì)胞株中表達(dá)量都降低;顯示FUT8低表達(dá)后細(xì)胞株粘附能力降低。
　　4、免疫熒光結(jié)果顯示FUT8低表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞株中，β-catenin蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，但其在細(xì)胞核、膜的分布發(fā)生了改變，膜上表達(dá)量明顯增加。
　　5、CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FUT8低表達(dá)細(xì)胞株增殖能力降低;流式細(xì)胞分析

7、結(jié)果表明FUT8低表組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響;而干擾組Bcl-2及cyclinD1蛋白表達(dá)水平均有所下降。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了FUT8穩(wěn)定轉(zhuǎn)染低表達(dá)細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231;劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明FUT8的低表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移;CCK8結(jié)果顯示FUT8能夠促進(jìn)腫瘤的增殖，Bcl-2、cyclinD1的檢測(cè)結(jié)果表明FUT8對(duì)MCF-7細(xì)胞株和MDA-MB-231細(xì)胞