YD277：一個(gè)全新的小分子化合物在三陰性乳腺癌的功能和機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本課題主要通過體內(nèi)體外各種生物學(xué)方法，探究YD277的抑癌效果和機(jī)制，并且為三陰性乳腺癌的治療提供新化療藥物和方向。
　　方法：
　　1.SRB法檢測細(xì)胞生存率，反應(yīng)藥物抑制癌細(xì)胞效果。首先得到ML264衍生物24個(gè)，以10μM濃度在細(xì)胞系HCT116，MDA-MB-231，HCC1806進(jìn)行處理48小時(shí)，鏡下可見大量漂浮變圓的凋亡細(xì)胞。甩干培養(yǎng)基后經(jīng)過TCA固定，晾干，SRB染色，1％冰醋酸洗脫晾干，10

2、mM Tris base溶解處理，酶標(biāo)儀檢測吸光值，篩選出有效的抑癌藥物YD277。使用潛在抑癌藥物YD277以不同的濃度在MCF10A，MCF7，T47D，SUM149PT，MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, Hs578t, HCC1806,HCC1937，十株細(xì)胞系驗(yàn)證抑癌效果，再次使用SRB的方法測定準(zhǔn)確每株細(xì)胞系準(zhǔn)確的IC50。最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選出MDA-MB-231，MDA-MB-468作為

3、研究的代表細(xì)胞系，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的材料。
　　2.EdU檢測細(xì)胞增殖
　　為了檢測藥物YD277影響細(xì)胞增殖情況，使用MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞系，以不同濃度YD277（0，3，10μM）處理24小時(shí)，以ML264（10μM）作為對(duì)照，然后用Click-iT EdU試劑盒進(jìn)行處理，最后封片拍照，所得結(jié)果用ImageJ和IPP軟件處理，從每個(gè)處理結(jié)果中選擇3張圖片，從中選取10個(gè)區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所得比值作為最后

4、結(jié)果。
　　3.細(xì)胞凋亡分析
　　為了論證YD277引起細(xì)胞增殖減少的原因，使用流式方法檢測藥物YD277引起細(xì)胞凋亡情況。使用MDA-MB-231和MDA-MB-468鋪板，用YD277不同濃度（0，1，3，10μM），ML264(10μM)作為對(duì)比，處理36小時(shí)后胰酶消化，每個(gè)細(xì)胞系分出三個(gè)對(duì)照組。離心去上清，用700ul Anti-AnnexinⅤ Binding buffer洗兩次，之后分別用AnnexinⅤ避光染色

5、30 min，離心，700 ul Binding buffer洗兩遍，PI染色，直接Accuri C6(BD)上機(jī)分析凋亡比例。
　　4.細(xì)胞周期試驗(yàn)
　　為了論證YD277引起腫瘤細(xì)胞增殖減少機(jī)制，使用流式方法檢測該藥物對(duì)細(xì)胞周期阻滯的影響。使用MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞系進(jìn)行鋪板，然后用YD277不同濃度(0，1，3，10μM)處理36小時(shí)，胰酶消化，用PBS洗兩次，離心去上清。
　　5.蛋白印

6、跡檢測一般周期和凋亡相關(guān)的蛋白的改變，用以探索凋亡機(jī)制。為了探討細(xì)胞周期和凋亡改變的機(jī)制，做了大量蛋白篩，使用MDA-MB-231和MDA-MB-468用不同濃度YD277（0，1，3，10μM）處理36小時(shí)，用細(xì)胞裂解液裂解，4℃，30 min，離心，蛋白定量，然后加4XSDS Loading Buffer，100℃5min煮樣，上樣，跑膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，各種抗體孵育14小時(shí)，二抗孵育2小時(shí)，曝光儀檢測檢測各個(gè)目標(biāo)條帶變化情況。

7、>　　6.ER-STRESS通路探討和驗(yàn)證
　　經(jīng)過篩查細(xì)胞凋亡通路蛋白，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積壓通路蛋白有明顯變化。尤其是TRAF-ASK-IRE1α通路變化顯著。在10cm培養(yǎng)皿種板MDA-MB-231和MDA-MB-468，貼壁后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siBIP，siIRE1α，siJnk(total)50nM濃度，24小時(shí)后消化，種板到48孔板。次日以多個(gè)濃度YD277(0.3-12μM)處理48小時(shí)，SRB檢測細(xì)胞增殖情況，計(jì)算比較IC50的改

8、變。
　　7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　檢測藥物體內(nèi)抑癌活性，對(duì)評(píng)價(jià)藥物作用有重要價(jià)值。購買4周齡雌性裸鼠，養(yǎng)一周適應(yīng)新環(huán)境后，用MDA-MB-231細(xì)胞系，按單側(cè)1X106，進(jìn)行雙側(cè)成瘤，一周后腫瘤生長均勻，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到10mm3進(jìn)行隨機(jī)分組。分成安慰劑組8只小鼠，YD27715mg/Kg處理組8只小鼠，YD27725mg/Kg處理組10只。陽性對(duì)照組（鹽酸表柔比星8mg/kg每兩天一次）4只小鼠作為實(shí)驗(yàn)技術(shù)性對(duì)照。該實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)

9、價(jià)藥物YD277在活體的治療作用和毒理作用。
　　結(jié)果：
　　1.通過SRB實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖率，以HCT116，MDA-MB-231，HCC1806三株結(jié)直腸癌和乳腺癌細(xì)胞作為篩選細(xì)胞系，從24個(gè)ML264衍生物中篩選出YD277作為潛在有效的研究藥物。癌細(xì)胞對(duì)這個(gè)藥物更加敏感，YD277是一個(gè)很有可能成為新的抗腫瘤新藥，因此需要充分研究該藥物的抑癌機(jī)制和抑癌效果。通過細(xì)胞系篩查，得到MDA-MB-231和MDA-MB-46

10、8的IC50在1.5-3μM之間。由于傾向研究三陰性乳腺癌的研究，并且MDA-MB-231易于活體成瘤，所以選擇這兩個(gè)細(xì)胞作為研究細(xì)胞系，作為進(jìn)行后續(xù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的材料。
　　2.EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，YD277顯著抑制乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468的DNA合成，減少細(xì)胞分裂，證明細(xì)胞增殖受到抑制。通過EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用不同劑量的YD277(0，3，10μM)和母合藥物ML264(10μM)作為對(duì)照，處理24

11、小時(shí)后，檢測發(fā)現(xiàn)兩株癌細(xì)胞在YD277作用下，DNA合成能力顯著下降，細(xì)胞分裂減慢，細(xì)胞增殖顯示出隨藥物濃度增加梯度下降。母合結(jié)構(gòu)ML264在24小時(shí)的處理時(shí)間不能顯著減少DNA合成。
　　3.流式凋亡實(shí)驗(yàn)證明，YD277明顯導(dǎo)致MDA-MB-231和MDA-MB-468兩株三陰性乳腺癌凋亡細(xì)胞比例增加。通過以不同劑量的YD277處理(0，1，3，10μM)，母合藥物ML26410μM作為對(duì)照，處理36小時(shí)后，鏡下可見藥物處理細(xì)胞

12、系明顯變形，漂浮，可見凋亡細(xì)胞。然后MDA-MB-231和MDA-MB-468分別用PI和AnnexinⅤ雙染，流式檢測凋亡比例。結(jié)果顯示隨著YD277濃度的升高，兩株細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡的比例顯著升高，顯示劑量效應(yīng)。
　　4.流式周期檢測顯示，YD277明顯導(dǎo)致MDA-MB-231和MDA-MB-468兩株三陰性乳腺癌G1期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。通過不同劑量的YD277(0，1，3，10μM)，以母合藥物ML264(10

13、μM)作為陽性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，藥物處理36小時(shí)，然后流式檢測細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的提高，YD277顯著引起G1期阻滯。結(jié)果跟鏡下顯示一致，因?yàn)閅D277不僅導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，還能導(dǎo)致細(xì)胞分裂減少，這可能部分是由于周期阻滯造成的。
　　5.使用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)經(jīng)過大量通路篩查表明，YD277明顯導(dǎo)致三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468一系列周期，凋亡和一些細(xì)胞信號(hào)通路蛋白的變化。通過不同劑量的YD277（0，1，

14、3，10μM）和母合藥物ML26410μM處理36小時(shí)后，用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，收蛋白。蛋白Bip，IRE1α，p-Jnk，p-C-Jun，CL-c3有顯著性變化，提示YD277可能部分通過誘導(dǎo)ER-STRESS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　6.藥物YD277可以部分通過ER-STRESS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，敲低基因Bip，IRE1α，Jnk(total)24小時(shí)后，重新鋪板貼壁后，以不同濃度YD277處

15、理，發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲低IRE1α后，IC50顯著性升高（10μM），而敲除Bip和tJnk后，挽救效果不如敲低IRE1α。該實(shí)驗(yàn)說明，IRE1α在YD277導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。
　　7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，YD277能有效抑制小鼠體內(nèi)移植瘤生長。經(jīng)過每隔一天，腹腔給藥28天的方式處理荷瘤裸鼠之后，發(fā)現(xiàn)與安慰劑相比，藥物 YD277在濃度15mg/Kg和25mg/Kg兩組能顯著抑制活體移植瘤(MDA-MB-231)的生長，藥物吸收良

16、好。對(duì)小鼠的體重影響沒有顯著性差異。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效說明經(jīng)過動(dòng)物體循環(huán)之后，藥物效果沒有發(fā)生很大變化，抑癌效果依然顯著。
　　結(jié)論：
　　YD277是一個(gè)新型的，能有效抑制三陰性乳腺癌增殖的小分子化合物。在體外實(shí)驗(yàn)中，YD277在1.5-3μM的處理濃度能有效抑制大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞系增殖，導(dǎo)致周期阻滯在G1期，減少細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)凋亡。然而它在這個(gè)濃度不影響正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A生長。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證明YD277能