天藍色鏈霉菌A3（2）中bldH基因的克隆與研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、該研究嘗試用不同的方法對bldH基因進行克隆.首先試圖通過轉座子標簽技術對bldH基因進行克隆.對攜帶有轉座子Tn4560的溫敏型復制性質粒pUC1169進行了一系列的改造,構建得到重組質粒pHZ2508,作為新轉座子的載體.該質粒在M145中具有較高的轉座頻率,并且可以通過對轉移接合子的直接篩選得到轉座突變株.由于發(fā)現pSPH2可以反式互補bldH突變株WC109,所以沒有繼續(xù)用pHZ2508進行WC109中bldH的克隆.pSPH2

2、的外源片段包含有3個完整的開放讀碼框（ORF）.將覆蓋該區(qū)域的科斯質粒2SCC13導入WC109,可以部分互補其光禿表型.對轉化子進行松弛培養(yǎng),篩選同質化（homogenolized）后代,即丟失2SCC13載體抗生的Km<'s>后代,發(fā)現同質化后代產孢表型發(fā)生分離,暗示WC109菌株的染色體在該區(qū)域發(fā)生了突變.為了進一步定位該突變基因,構建了一系列的亞克隆,并將它們導入WC109.觀察產孢表型,將具有使WC109部分恢復產孢功能的區(qū)域

3、濃縮定位adpA<,sc>基因.通過PCR擴增分別克隆得到WC109和WC181兩種bldH突變株的adpA<,sc>基因,并分別進行測序.將adpA<,sc>基因中的TTA密碼子定點誘變成為其簡并密碼子TTG,得到定點誘變基因adpA<,sc><'*>分別引入到整合型載體pSET152和低拷貝載體pHJL401上,然后導入bldA突變株J1700中,發(fā)現adpA<,sc><'*>基因只有至少存在1～10個拷貝時才可以明顯地使J1700

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