豬細小病毒2型間接ELISA與間接免疫熒光檢測方法的建立及血清流行病學(xué)初步調(diào)查.pdf

1、豬細小病毒病是由豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)引起的在母豬特別是初產(chǎn)母豬中不孕、流產(chǎn)，死胎、木乃伊胎等繁殖障礙綜合性疾病。該病在全球范圍內(nèi)廣泛存在，間接或直接造成了養(yǎng)豬業(yè)重大的經(jīng)濟損失。近年來，研究發(fā)現(xiàn)PPV出現(xiàn)了很多新的變異株。其中，豬細小病毒2型(Porcine parvovirus，PPV2)是2001年在緬甸豬戊型肝炎(HEV)研究過程中新發(fā)現(xiàn)的細小病毒科的成員，與傳統(tǒng)的豬細小病毒（豬細小病毒1型）親

2、緣性較遠。迄今為止，只在緬甸和中國有相關(guān)報道。我們在進行浙江省爆發(fā)的豬高熱病相關(guān)研究中，分離到了PPV2，針對該病毒進行了一系列的研究。為了加強對該病的疫情監(jiān)測和血清流行病學(xué)調(diào)查，有必要研發(fā)出一種在特異性和敏感性均較高的血清學(xué)檢測方法。
　　 本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了PPV2 VP2蛋白，在本實驗室孫宗英的基礎(chǔ)上探索性復(fù)核了間接ELISA檢測方法:將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達，而后通過提取包涵體

3、，His親和層析法純化，透析法復(fù)性。將該重組蛋白作為抗原包被酶標板，以PCR陽性混合血清作為陽性血清及某豬場未吃初乳的新生仔豬陰性血清作為一抗血清，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗豬IgG作為二抗，建立了針對PPV2 VP2抗體的間接ELISA。在方法復(fù)核過程中，對該間接ELISA各種反應(yīng)條件進行調(diào)整，確定了最適工作條件。最后，重復(fù)性試驗（批內(nèi)，批間），敏感性試驗結(jié)果表明，該方法是可靠的。同時利用本實驗室徐雅萍建立的PPV2-ORF

4、2重組腺病毒，對PPV2ORF2進行了真核表達，建立了針對PPV2ORF2間接免疫熒光檢測方法。在試驗過程中，對IFA使用的細胞系，接毒時間，固定液及固定時間，一抗反應(yīng)濃度及反應(yīng)時間，二抗FITC反應(yīng)濃度及反應(yīng)時間進行了摸索，最后對建立好的方法的特異性，敏感性及重復(fù)性進行了測定。實驗結(jié)果證明，該檢測方法可靠。
　　 使用建立好的間接ELISA和間接免疫熒光方法對采集自華東地區(qū)的357份豬血清進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)間接ELISA方法檢