Rab27B參與肝細胞癌轉移的機制研究.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見的、致死率極高的惡性腫瘤,每年約650,000人死于HCC,且其發(fā)病率有逐漸增高的趨勢。HCC的轉移是影響其術后治療效果和預后的最大障礙,是導致HCC高死亡率的主要原因。HCC的轉移主要是肝內轉移,肝臟外部轉移很少見。HCC的轉移是一個連續(xù)、漸進的多因素、多步驟動態(tài)的過程。目前,盡管對HCC轉移進行了大量研究,發(fā)現了一些與HCC轉移相關的分子,但都是對某一分子

2、與HCC轉移的關系的研究,僅僅從某一個側面證明了其與HCC轉移的關系,并沒有從整體上分析和了解HCC轉移過程及其發(fā)生機制,所以HCC轉移的分子機制并不清楚。
　　前期研究發(fā)現Rab27B分子在高轉移細胞株表達上調,因此可作為潛在的HCC轉移標志物進行深層次的功能驗證。Rab GTPase是機體內一組的與內膜運輸相關的調節(jié)蛋白,其中Rab27亞族包括兩個成員:Rab27A和Rab27B。Rab27B主要通過其效應分子的相互作用來發(fā)揮

3、功能,其主要功能是參與大多數分泌性細胞的胞吐作用及運輸過程。
　　為了進一步研究Rab27B參與HCC轉移的分子機制,我們采用RNAi技術抑制HCC細胞系中Rab27B的表達,以確定其是否與HCC轉移相關,并探索其參與HCC轉移的機制,在此基礎上通過臨床樣本驗證其能否作為診斷HCC轉移的候選標志物。本研究選取具有較高轉移能力的HCC細胞株HCC97H作為細胞模型,首先通過構建針對Rab27B的特異性的shRNA質粒載體,通過轉染H

4、CC97H,篩選到特異性抑制Rab27B表達的shRNA,并經G418篩選得到穩(wěn)定敲低Rab27B的HCC97H細胞株-shRab27B細胞株,與此同時也得到陰性對照穩(wěn)定細胞株-mock細胞株,通過RT-PCR及Western Bloting鑒定其Rab27B的表達水平與正常HCC97H細胞相比顯著下降。
　　HCC的轉移過程中涉及到細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲等方面的性質,因此本研究也從這幾個方面進行。首先,在體外通過實驗比較s

5、hRab27B、mock和HCC97H細胞株的增殖、黏附、遷移和侵襲能力,結果顯示穩(wěn)定敲低Rab27B的HCC97H細胞株shRab27B細胞與mock及HCC97H細胞相比,其體外貼壁增殖、黏附、遷移和侵襲能力均顯著下降,這說明Rab27B表達量的降低抑制細胞的轉移過程,也即體外實驗證明Rab27B與HCC的轉移過程相關。隨后,進一步通過體內實驗即裸鼠荷瘤轉移模型進行驗證,通過向裸鼠脾臟接種shRab27B和mock細胞,觀察腫瘤的肝

6、臟轉移及肺臟轉移情況,接種細胞8周后mock組肝臟腫瘤轉移灶質量要顯著大于shRab27B組,且接種shRab27B組肝臟轉移灶出現的時間要顯著晚于mock組的出現時間,這表明Rab27B表達的降低抑制了HCC97H細胞的裸鼠體內的轉移和侵襲能力。通過體內外實驗確定Rab27B與HCC的轉移相關。
　　在確定Rab27B與HCC轉移相關的基礎上,進一步探討其參與HCC轉移的機制,即其是如何調控HCC轉移過程的。Rab27B主要參與

7、調控細胞的囊泡運輸過程,在細胞內囊泡定位運輸至胞膜的過程中發(fā)揮了重要作用,因此,我們推斷Rab27B表達量的降低抑制了HCC97H細胞的囊泡分泌過程,從而降低了參與HCC轉移的重要分子的分泌量。經過實驗驗證,可知在胞外分泌蛋白中,shRab27B細胞分泌的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和肝細胞生長因子(HGF)的量與mock和HCC97H細胞相比顯著下降,uPA和HGF及其受體在腫瘤的轉移過程中發(fā)揮了重要的作用。因此,我們確定HCC9

8、7H細胞中Rab27B表達量的降低抑制了uPA和HGF的分泌過程,從而抑制了HCC97H細胞的轉移過程。
　　隨后收集不同時期HCC病人臨床血清,通過ELISA實驗測定Rab27B的表達量,在已發(fā)生轉移的HCC病人血清中Rab27B的含量要顯著高于未發(fā)生轉移的,因此Rab27B可作為診斷HCC轉移的潛在標志物用于臨床診斷。
　　本課題采用RNAi技術建立穩(wěn)定敲低Rab27B表達水平的HCC97H細胞株,通過體內外實驗確證Ra