人呼吸道合胞病毒(HRSV)低溫傳代株穩(wěn)定性的研究.pdf

1、本研究課題目的是分析HRSV A2株經(jīng)低溫培養(yǎng)傳代后毒力改變的情況及穩(wěn)定性檢測，為疫苗的開發(fā)做基礎(chǔ)研究。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括：HRSV在KMB17上于32℃連續(xù)傳代、低溫傳代株遺傳穩(wěn)定性檢測、在不同溫度及物理?xiàng)l件下HRSV穩(wěn)定性的觀察及核酸熒光染色法觀察HRSV合胞現(xiàn)象。 HRSV在KMB17上于32℃連續(xù)傳代已至35代，病毒培養(yǎng)增殖時(shí)間在7—10天左右，感染性滴度在7.0-7.5 lgCCID50/ml之間，表明HRSV已慢慢適

2、應(yīng)KMB17細(xì)胞，為培養(yǎng)細(xì)胞基質(zhì)的更換(使用二倍體細(xì)胞培養(yǎng)病毒)及減毒株的篩選奠定良好基礎(chǔ)。 遺傳穩(wěn)定性觀察包括：一步生長曲線、免疫原性及核酸序列檢測。本實(shí)驗(yàn)對低溫培養(yǎng)的第5、19、28和34代做了一步生長曲線觀察，結(jié)果表明HRSV在低溫下的適應(yīng)性，即低溫傳代代次較高的病毒在32℃病變時(shí)間越來越短，感染性滴度也越來越高，至34、35代時(shí)感染性滴度已穩(wěn)定在7.5lgCCID50/ml。另外，實(shí)驗(yàn)選擇經(jīng)低溫培養(yǎng)的第21和26代病毒進(jìn)

3、行動物實(shí)驗(yàn)，檢測其免疫原性。結(jié)果顯示，低溫傳代的HRSV減毒程度還不夠，仍能致靶器官組織產(chǎn)生明顯炎癥及間質(zhì)性肺炎；且抗原性不強(qiáng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)約為1：2—1：8。最后實(shí)驗(yàn)對低溫培養(yǎng)的不同代次病毒進(jìn)行了G蛋白基因核酸序列測定，通過對低溫傳代株P(guān)15、P20、P25的序列比對，未發(fā)現(xiàn)編碼G蛋白基因發(fā)生變異。 HRSV在不同溫度保存及物理?xiàng)l件處理后穩(wěn)定性觀察，結(jié)果顯示HRSV穩(wěn)定性較差，在37℃和室溫下保存都不穩(wěn)定，感染

4、性滴度每天分別下降1.0-2.0 lgCCID50/ml和0.2-0.8 lgCCID50/ml；在4℃下感染性滴度下降較慢，存放5周之后，病毒滴度變化<0.6 lgCCID50/ml，可短暫保存；—20℃保存3個(gè)月后滴度僅下降0.5 lgCCID50/ml，為保證感染性滴度穩(wěn)定HRSV需保存于—20℃或更低溫度。HRSV在凍融之后，病毒感染性滴度呈明顯下降趨勢，每凍融1次，病毒感染性滴度下降約1.30 lgCCID50/ml。經(jīng)超聲波

5、處理后，HRSV病毒感染性滴度下降更快，超聲處理2次后，病毒幾乎無感染性。 鑒于HRSV穩(wěn)定性差，實(shí)驗(yàn)在病毒液中加入保護(hù)劑后觀察了滴度下降的情況。結(jié)果顯示，保護(hù)劑對病毒熱不穩(wěn)定性和凍融不穩(wěn)定性均起到穩(wěn)定作用。 核酸熒光染色法觀察HRSV在幾種細(xì)胞上的合胞體現(xiàn)象。其中Hep—2細(xì)胞是HRSV病變最快的細(xì)胞，在培養(yǎng)24h后，可看見合胞現(xiàn)象；Vero細(xì)胞病變時(shí)間次之，KMB17細(xì)胞最慢，且病變形態(tài)不同于前兩者?？赡芘c病毒對細(xì)胞