人呼吸道合胞病毒微型基因組的研究.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)是導致嬰幼兒嚴重下呼吸道感染的最重要的病毒病原，目前尚無有效的防治方法。利用RNA病毒反向遺傳學操作獲得的減毒RSV活病毒，具有穩(wěn)定的安全性和良好的免疫原性，用于制備RSV疫苗有較好的前景。該技術的關鍵在于首先得到含有整個病毒基因組的感染性cDNA克隆，然后在培養(yǎng)細胞中重新拯救出活病毒。RSV基因組為單股負鏈RNA，為加深對其基因組復制特

2、性的認識，積累RSV拯救的必要知識，擬先嘗試構建微型基因組(minigenome)，即在RSV轉錄起始和終止信號之間插入報告基因或較短的病毒基因組片段，兩端為病毒RNA復制轉錄所必需的病毒前導序列和尾隨序列等調控序列，構成cDNA來源的微型基因組，與表達輔助蛋白(N、P、L、M2-1)的重組質粒共轉染或以RSV病毒作為輔助病毒在細胞內進行復制和轉錄，通過鑒定報告基因的表達即可初步鑒定所建立的微型基因組的功能。目前常用T7 RNA聚合酶(

3、T7 RNAPolymerase，T7 RNP)將含有病毒微型基因組的重組質粒在細胞內轉錄合成病毒的基因組。RNA。本研究旨在探討T7轉錄系統(tǒng)及功能，并進一步構建攜帶增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein，EGFP)基因的RSV微型基因組重組質粒，通過轉染可表達T7 RNP的BSRT7/5細胞系，并以RSV作為輔助病毒觀察EGFP的表達情況，明確RSV微型基因組的功能，為研究RSV感染性c

4、DNA奠定基礎。 方法：根據(jù)編碼T7 RNP的基因序列，設計一對引入EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ酶切位點的引物。提取含有T7 RNP的Ecoli BL21(DE3)基因組DNA，以該DNA為模板，應用PCR技術，擴增T7 RNP全長基因，經(jīng)過中間載體將其克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)。與此同時，將px8δt載體切下的T7 RNP轉錄識別的終止信號(Terminator，TER)和從pGEM-T easy/EGFP上切下的E

5、GFP基因克隆至pcDNAⅡ，且保證EGFP位于T7啟動子與TER之間。將獲得的兩個重組質粒共轉染BHK細胞。48 h后，通過熒光顯微鏡觀察EGFP在真核細胞內的表達情況。同時，根據(jù)文獻獲得RSV轉錄復制時所需的最小順式作用元件，即轉錄起始(Gene Start，GS)信號和轉錄終止(Gene End，GE)信號以及基因組啟動子(Leader)與反基因組的啟動子(Trailer)序列。設計好信號序列的順序并在其中引入多克隆酶切位點，命名

6、為GSGE，基因合成得到GSGE的cDNA，以該段序列為模板合成兩對分別在上下游帶有T7啟動子的引物，同時在T7啟動子端引入Hind Ⅲ酶切位點，行PCR，得到的產(chǎn)物分別命名為GSGE1和GSGE2，之后將這兩段序列克隆入px8δT載體，并進一步將EGFP基因定向克隆至其中得到兩個含有RSV微型基因組的重組載體，分別命名為px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。為驗證這兩個重組載體中RSV微型基因組的功能，通

7、過脂質體法轉染BSR T7/5細胞系，進一步利用RSV作為輔助病毒提供RSV轉錄和復制必須的所有功能蛋白，72h后在倒置熒光顯微鏡下觀察報告基因EGFP的表達情況。 結果：成功構建了真核表達載體pcDNA3.1(+)/T7 RNP和重組載體pcDNAⅡ/EGFP/TER。在共轉染BHK細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到EGFP表達的綠色熒光。成功構建含有RSV微型基因組的px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGF

8、P載體，轉染BSR T7/5細胞，以RSV作為輔助病毒，倒置熒光顯微鏡下觀察到BSR T7/5細胞表達綠色熒光。 結論：pcDNA3.1(+)/T7 RNP可在真核細胞BHK內表達T7 RNP，通過與T7啟動子和TER的相互作用，實現(xiàn)了pcDNA Ⅱ/EGFP/TER中EGFP基因的轉錄及表達。構建的帶有RSV微型基因組的重組載體，在RSV的輔助下可實現(xiàn)EGFP的成功表達，微型基因組具有RSV病毒轉錄和復制的功能，為進一步的RS