P203L和V395I突變在NOK介導的腫瘤生成與轉移中的作用.pdf

1、受體型酪氨酸激酶是存在于機體內一類具有廣泛生理調節(jié)作用的蛋白酶類，它們調控著細胞許多生理生物學活動，包括細胞的增殖與分化、細胞的周期調控與代謝、胚胎的形成于發(fā)育等等。NOK(Novel Oncogene with Kinase Domain)是一個最新被鑒定的受體型酪氨酸激酶。NOK因缺少完整的胞外結構域和DFG結構域而因此被認為是一類不具備生物學活性的假激酶。盡管如此，我們實驗室通過前期工作發(fā)現(xiàn)，NOK是一個癌基因，能在體內誘導癌癥的

2、發(fā)生和轉移。目前，關于NOK的研究并不多，其導致腫瘤生成和轉移的具體分子機制也不清楚。本研究旨在從NOK基因結構出發(fā)，尋找其結構與功能之間的關聯(lián)性，明確NOK導致腫瘤生成和轉移的信號通路，為闡明其分子機制，為癌癥的診斷和治療提供分子生物學基礎。
　　本研究利用體外定點突變技術克隆構建了含有不同位點突變和結構域突變的共九個NOK突變子，并分別構建了pCDNA3.0-NOK-HA/NOK-Mutant-HA真核表達質粒和pCDH-CM

3、V-MCS-EF1-GFP-CD511B-NOK-HA/NOK-Mutant-HA慢病毒包裝質粒及相應BaF3穩(wěn)定細胞系。
　　我們首先檢測了STYK1（即P203L突變）和V395I突變對自身磷酸化水平和激酶活性的影響。結果發(fā)現(xiàn)STYK1和V395I突變均未影響到NOK的激酶活性，但V395I輕微抑制了自身的磷酸化。隨后，我們研究了突變對信號通路的影響。在HEK293T細胞中，NOK的高表達能顯著性升高ERK和Akt的磷酸化程度

4、。但突變V395I并未削弱NOK所介導的ERK和Akt的磷酸化，而突變STYK1則抑制了這兩條信號通路。并且，兩者都抑制了諸如STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化活化。在HeLa細胞中，STYK1同時抑制了ERK和Akt的磷酸化，但V395I僅抑制了ERK的磷酸化。而在JAK-STAT這條信號通路中，STYK1和V395I均抑制了STAT1和STAT3的磷酸化水平，但是對STAT5的影響不明顯。最后，在穩(wěn)定細胞系中，我們發(fā)現(xiàn)突變S

5、TYK1和V395I不僅顯著性地抑制了STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化，而且還抑制了ERK的磷酸化。同時，STYK1而非V395I顯著性地降低了NOK的磷酸化水平。細胞增殖試驗檢測了突變對細胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)STYK1和V395I抑制了細胞的增殖能力。我們還發(fā)現(xiàn)與NOK相比，STYK1組誘導的集落形成數(shù)量明顯降低，約為NOK組的1/35，V395I組的集落形成數(shù)量也有降低，約為NOK組的1/4。以上結果說明了突變STYK1和V

6、395I抑制了NOK介導的細胞的增殖和轉化及相關信號的傳導。
　　在動物模型中，我們研究了NOK及其突變體在裸鼠體內的成瘤能力和相應的腫瘤轉移能力。發(fā)現(xiàn)與對照組細胞相比，實驗組均可以導致腫瘤的形成和轉移，但和NOK組的成瘤能力相比，突變組導致腫瘤形成的能力減弱，腫瘤形成的時間明顯滯后。在實驗組中，NOK組裸鼠平均存活時間約為1.5月，而STYK1組和V395I組裸鼠平均存活時間約延長至2.5-3.0月。各臟器腫大情況以NOK組最為

7、明顯，其中肝臟和脾臟的腫大較STYK1組和V395I組嚴重。在NOK組裸鼠的肝臟表面可見明顯結節(jié)狀腫瘤轉移灶甚至成片轉移灶，而在注射突變子的裸鼠肝臟表明則很少看到明顯轉移灶的產(chǎn)生。蘇木精-伊紅(HE)染色發(fā)現(xiàn)，在V395I和STYK1中，V395I組肝臟和脾臟的浸潤程度均高于STYK1組。我們利用流式細胞儀分析了各臟器中腫瘤的轉移情況，并進行了腫瘤轉移的相對定量分析，結果也顯示了各臟器腫瘤侵襲的不同情況。
　　此外，利用免疫沉淀和

8、質譜鑒定技術，我們研究了與NOK可能發(fā)生相互作用的蛋白。用質譜技術鑒定到了約40余種有可能與NOK發(fā)生相互作用蛋白，并且這些蛋白都是功能研究比較少的，其中有至少1/4為未知功能蛋白。包括MYO9，MYO10，MYO14，F(xiàn)LNA，EHILI，BCLF1，MCM5，LAS1L，F(xiàn)AS，MYO6，U520和DZSP等等，其中不乏與腫瘤轉移相關的蛋白如MYO10和MYO6等。這些蛋白可能在NOK介導的腫瘤生成和轉移過程中發(fā)揮著關鍵作用。