人參皂甙Rg3對人肺鱗癌SK-MES-1細胞生物學行為的影響.pdf

1、肺癌是當今世界發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤,而且呈現(xiàn)不斷攀升的趨勢,其5年生存率僅有15％左右。近年來,隨著診療方法的進步,合理地綜合應用現(xiàn)有的手術、放療和化療等幾種治療手段,肺癌的某些亞型治愈率已經(jīng)有所提高,但總體療效仍不理想。日益增加的肺癌患者人數(shù)和較低的治愈率已經(jīng)成為當前困擾全世界醫(yī)務工作者的難題。根據(jù)肺癌的組織學表現(xiàn)將其分為鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗癌、小細胞癌、大細胞癌等亞型,其中肺鱗癌約占所有原發(fā)性肺癌的35％～45％。

2、　　 惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移是一個復雜的生物學過程,包括癌基因的活化、瘤細胞凋亡與增殖失衡、瘤組織新生血管形成、瘤細胞脫落并侵入基質(zhì)等步驟。在這一系列的過程中,各個步驟相互作用又相對獨立,只要某一個步驟未獨立完成,腫瘤的生長和侵襲就不能得以實現(xiàn)。
　　 人參是一種五加科多年生草本植物,作為一種中藥,在我國有幾千年的應用歷史。人參具有廣泛的藥用價值,其主要活性成分人參皂甙具有抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化等作用。目前從人參中分離提純

3、獨立的人參皂甙成分并揭示其作用機制已經(jīng)成為各國學者研究的熱點。人參皂甙Rg3是人參皂甙的一種,已有研究表明Rg3具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤新生血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥性等多種抗腫瘤活性。因此,人參皂甙Rg3作為一種重要的腫瘤輔助治療藥物,具有廣泛的臨床應用前景。有關Rg3對肺鱗癌SK-MES-1細胞增殖、凋亡、侵襲影響的研究,除本課題組前期發(fā)表的相關文章外,迄今國內(nèi)外未見其他文獻報道

4、。
　　 為深入探討人參皂甙Rg3對肺鱗癌SK-MES-1細胞增殖、凋亡、侵襲的影響,尋求除手術、放療和化療以外肺鱗癌有效的治療方法,本研究首先采用MTT比色法、流式細胞儀、免疫細胞化學、原位雜交、RT-PCR、Western-blot等技術聯(lián)合檢測了人參皂甙Rg3在體外對肺鱗癌SK-MES-1細胞增殖、凋亡的影響及對凋亡相關基因survivin、livin mRNA、蛋白質(zhì)表達水平的影響,探討了Rg3誘導SK-MES-1細胞凋

5、亡的分子機制；進一步運用Boyden小室侵襲實驗、RT-PCR、Western-blot、酶聯(lián)免疫吸附試驗、明膠酶譜法等技術檢測了Rg3在體外對肺鱗癌SK-MES-1細胞侵襲及對基質(zhì)金屬蛋白酶表達的影響及其調(diào)控機制；最后在此基礎上建立裸鼠移植瘤模型,采用TUNEL、原位雜交、免疫組化等技術檢測了Rg3在動物模型體內(nèi)對瘤細胞凋亡、增殖及survivin、livin表達的影響,并檢測了Rg3在體內(nèi)對基質(zhì)金屬蛋白酶及其調(diào)控分子CXCL12、C

6、XCR4的影響,進一步闡明了Rg3誘導SK-MES-1細胞凋亡、抑制其侵襲的機制與下調(diào)survivin、livin及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達密切相關。為探討人參皂甙Rg3對肺鱗癌SK-MES-1細胞生物學行為的影響及其機制,為人參皂甙Rg3的臨床應用提供進一步的理論基礎,本研究分以下3個部分進行了系列研究。
　　 第一部分人參皂甙Rg3對肺鱗癌SK-MES-1細胞增殖、凋亡的影響
　　 方法：
　　 1.采用MTT法

7、測定經(jīng)5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Rg3分別作用24h、48h、72h后SK-MES-1細胞增殖活性的改變,并于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。
　　 2.采用流式細胞儀測定人參皂甙Rg3對SK-MES-1細胞凋亡的影響。
　　 3.采用RT-PCR和原位雜交技術檢測人參皂甙Rg3對SK-MES-1細胞survivin、livin mRNA表達的影響。
　　 4.采用免疫細胞化學和Weste

8、rn-blot技術檢測人參皂甙Rg3對SK-MES-1細胞survivin、livin蛋白表達的影響。
　　 5.統(tǒng)計學處理:應用SPSS17.0軟件處理,采用單因素方差分析和LSD多重比較法。檢驗水準α=0.05。
　　 結果：
　　 1.Rg3作用后細胞的增殖活性受到明顯抑制,不同濃度組間(P<0.05)、不同時間組間(P<0.05)均存在顯著性差異。Rg3作用48 h后細胞生長抑制率達最高水平。Rg3作用后

9、細胞的形態(tài)發(fā)生改變,且隨藥物濃度增加而更為顯著。
　　 2.流式細胞術顯示,隨著Rg3濃度增加,細胞凋亡率逐漸增加,各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.RT-PCR和原位雜交聯(lián)合檢測結果顯示,Rg3作用后,survivin和livinmRNA表達均受到抑制,隨Rg3濃度增加,survivin和livin表達均逐漸降低,不同濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.免疫細胞化學和We

10、stern-blot技術聯(lián)合檢測結果顯示,Rg3作用后,survivin和livin蛋白表達均受到抑制,且具有一定的劑量依賴性,不同濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 第二部分人參皂甙Rg3對肺鱗癌SK-MES一1細胞侵襲力的影響及其機制
　　 方法：
　　 1.采用Boyden chamber侵襲實驗計算不同濃度Rg3作用后穿膜的SK-MES-1細胞數(shù),以比較Rg3對細胞侵襲能力的影響。
　

11、　 2.采用明膠酶譜法檢測Rg3對MMP-2,MMP-9活性的影響。
　　 3.采用RT-PCR和Western-blot技術分別檢測Rg3對SK-MES-1細胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響。
　　 4.采用ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清中CXCL12、CXCR4水平。
　　 5.采用RT-PCR和Western-blot技術分別檢測Rg3對SK-MES-1細胞CXCL12、CXCR4 mRN

12、A和蛋白表達的影響。
　　 6.統(tǒng)計學處理:應用SPSS17.0軟件處理,采用單因素方差分析和LSD多重比較法。檢驗水準α=0.05。
　　 結果：
　　 1.Boyden chamber體外侵襲實驗結果顯示,隨著Rg3濃度增加,穿越Matrigel膠的SK-MES-1細胞數(shù)逐漸減少,不同濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 2.明膠酶譜法顯示,隨著Rg3濃度增加,MMP-2和MMP-9酶活力

13、逐漸降低,不同濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.RT-PCR和Western-blot結果顯示,隨著Rg3濃度增加,MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表達逐漸降低,不同濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.ELISA法檢測提示,經(jīng)Rg3作用后,SK-MES-1細胞培養(yǎng)上清中的CXCL12、CXCR4含量顯著降低,不同濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 5.Rg3

14、作用后,CXCL12和CXCR4 mRNA和蛋白表達降低,具有一定的劑量依賴性,不同濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 第三部分人參皂甙Rg3對肺鱗癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其機制
　　 方法：
　　 1.建立裸鼠SK-MES-1細胞移植瘤模型,通過灌胃給予不同劑量的Rg3,比較各組裸鼠成瘤大小。
　　 2.應用TUNEL法檢測各組裸鼠腫瘤組織中SK-MES-1細胞凋亡情況。
　　 3

15、.采用原位雜交和免疫細胞化學技術分別檢測各組裸鼠腫瘤組織中survivin、livin mRNA和蛋白的表達情況。
　　 4.采用原位雜交和免疫細胞化學技術分別檢測各組裸鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達情況。
　　 5.采用原位雜交和免疫細胞化學技術分別檢測各組裸鼠腫瘤組織中CXCL12、CXCR4 mRNA和蛋白的表達情況。
　　 6.統(tǒng)計學處理:應用SPSS17.0軟件處理,采用單因素

16、方差分析和LSD多重比較法。檢驗水準α=0.05。
　　 結果：
　　 1.隨著給予裸鼠的Rg3劑量增加,裸鼠移植瘤體積逐漸減小,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 2.TUNEL法顯示,隨著給予裸鼠的Rg3劑量增加,瘤組織內(nèi)SK-MES-1細胞凋亡率逐漸增加,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.給予Rg3后,裸鼠瘤組織內(nèi)survivin、livin mRNA和蛋白表達

17、均降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.隨著給予裸鼠的Rg3劑量增加,裸鼠瘤組織內(nèi)MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達均逐漸降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 5.給予Rg3后,裸鼠瘤組織內(nèi)CXCL12、CXCR4 mRNA和蛋白表達均降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.人參皂甙Rg3能夠抑制肺鱗癌SK-MES-1

18、細胞增殖并能夠抑制SK-MES-1細胞移植瘤的生長。
　　 2.人參皂甙Rg3在體外和動物模型體內(nèi)具有誘導肺鱗癌SK-MES-1細胞凋亡的作用,其作用機制可能與下調(diào)凋亡基因survivin、livin在mRNA和蛋白水平的表達有關。
　　 3.人參皂甙Rg3能夠降低SK-MES-1細胞的侵襲能力,其作用機制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9在mRNA和蛋白水平的表達,降低MMP-2、MMP-9的酶活力有關。