利用siRNA抑制VEGF-C抗乳腺癌血管形成的研究.pdf

1、目的：血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor-C VEGF-C)通過對腫瘤間質新生淋巴管內皮細胞的增殖和遷移的調控，促進腫瘤的淋巴管形成。本研究應用經過化學修飾的小干擾RNA(smallinterference RNA，siRNA)在體內外抑制VEGF-C的表達，探討化學修飾的siRNA介導的RNA干擾技術對乳腺癌基因治療的可行性和特異性。 方法：設計針對VEGF-C基因的小干擾

2、RNA，選用陽離子脂質體jetPEITM2000作為轉染試劑。在體外實驗中，以脂質體轉染法將雙鏈siRNA導入人乳腺癌細胞株MCF-7細胞，設立空白對照組（轉染試劑中只加無血清無抗生素培養(yǎng)基）、脂質體組（轉染試劑中只加jetPEITM20000.5μl/孔）、3個siRNA濃度梯度組(50、100、200 nmol/L)及siRNA SCR組(100 nmol/L)，用四甲基偶氮唑藍(MTT比色法)檢測siRNA對MCF-7細胞增殖的影

3、響。通過Hoechst33258染色觀察MCF-7細胞的凋亡，采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測轉染前后VEGF-C基因和p53基因的mRNA表達水平，蛋白印記試驗(Western blot)檢測VEGF-C基因和p53基因的蛋白水平表達變化：在體內實驗中，于雌裸鼠皮下種植MCF-7細胞制備動物模型，將成瘤陽性的裸小鼠隨機分為VEGF-C siRNA處理組、脂質體組和對照組，每組5只。VEGF-C siRNA處理組腫瘤局部注射V

4、EGF-C siRNA1 mg/kg與jetPEITM混合物，脂質體組腫瘤局部注射jetPEITM2000（濃度與上述處理組相同）和PBS，對照組僅注射PBS。每3d注射1次，連續(xù)8次。22d后拉頸處死全部動物，取腫瘤，采用半定量RT-PCR分析VEGF mRNA水平，Western blotting檢測VEGF-C蛋白表達水平。 結果：體外實驗結果顯示：VEGF-C siRNA轉染乳腺癌MCF-7細胞后，VEGF-C siRN

5、A三個濃度組細胞增長明顯減慢，細胞生長抑制率分別達26.12％、50.01％、52.21％，VEGF-C siRNA終濃度為100nmol/L時達最佳抑制效果(50.01％)。Hoechst33258熒光染色顯示轉染siRNA72h后細胞內可見凋亡小體，RT-PCR實驗結果顯示：與正常對照組比較，VEGF-C siRNA處理組明顯下調了VEGF-C基因與p53基因mRNA的表達(P<0.01)。Western blot檢測顯示：與正常對

6、照組比較，VEGF-C siRNA處理組蛋白VEGF-C和p53的表達顯著下調（P<0.01）?？瞻讓φ战M、脂質體組和siRNA SCR組各指標無顯著變化。體內實驗結果顯示：siRNA治療組裸鼠生長狀態(tài)良好，體重穩(wěn)定，瘤組織的增長受到明顯抑制，RT-PCR及Western blot均顯示VEGF-C基因的mRNA和蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），對照組各指標無顯著變化。 結論：化學修飾的siRNA介導的RNAi在體內外均能