14-3-3γ通過mTOR信號通路調控奶牛乳腺上皮細胞乳合成機理.pdf

1、14-3-3γ通過mTOR途徑調節(jié)奶牛乳腺上皮細胞乳合成乳品質是乳品工業(yè)的重要基礎，而乳蛋白含量是乳品質的代表性指標。近年來，隨著乳品工業(yè)的發(fā)展和健康消費的需求，人們對乳制品的需求越來越多。但在中國和很多發(fā)展中國家，生乳品質低下已成為制約奶牛飼養(yǎng)行業(yè)的關鍵因素。研究人員開始聚焦如何提高乳品質和產量，而通過現(xiàn)代分子生物學方法闡明乳蛋白和乳脂肪合成的調控機理已成為這一領域的主要研究內容。國內外研究已取得了一定的進展，已證實PI3K/AKT/

2、mTOR是調控細胞生長和增殖的主要信號通路，而在奶牛乳腺上皮細胞營養(yǎng)素和激素能夠通過mTOR信號通路調節(jié)乳的合成。
　　14-3-3蛋白家族成員廣泛存在于各類生物組織細胞中，參與很多生物學過程，如細胞生長、細胞周期、增殖、代謝、基因轉錄、信號轉導、蛋白質合成等。14-3-3蛋白通過決定底物的亞細胞定位以促進和抑制有關的信號轉導如mTOR信號通路過程。盡管已有很多這方面的報道，但還不清楚14-3-3是否通過mTOR信號通路調節(jié)乳合成

3、和細胞增殖。本實驗室前期蛋白質組學研究工作發(fā)現(xiàn)，14-3-3γ與乳蛋白合成相關，但其作用機制尚不清楚。因此本文通過基因功能研究以闡明14-3-3γ是否通過調節(jié)乳合成和細胞增殖。
　　首先采用組織塊法培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細胞，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞角蛋白18和β-酪蛋白的表達以確定細胞純化成功并具有泌乳的能力。激光共聚焦顯微鏡觀察表明14-3-3γ定位于細胞漿和細胞核。Western blotting分析表明，蛋氨酸、賴氨酸、

4、雌激素和催乳素均能刺激14-3-3γ表達，HPLC檢測發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白的分泌也顯著增加，甘油三酯試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)乳脂肪的分泌也顯著增加，CASY細胞活力分析儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞活力和細胞數也顯著增加。這些結果提示14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細胞泌乳和增殖過程中起著正向調節(jié)作用。
　　構建pGCMV-IRES-EGFP-14-3-3γ表達載體，并轉入原代奶牛乳腺上皮細胞，繼而利用G418篩選構建了穩(wěn)定轉染14-3-3γ的原代奶牛乳腺上皮細胞系

5、，以此為材料研究14-3-3γ對奶牛乳腺上皮細胞泌乳和增殖的影響。發(fā)現(xiàn)14-3-3γ過表達后，mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表達顯著上調，細胞活力和細胞數顯著增加，細胞分泌酪蛋白和甘油三酯顯著增多。
　　另一方面，將14-3-3γ的siRNA利用瞬時轉染技術轉入原代奶牛乳腺上皮細胞，觀察其對泌乳和增殖的影響。發(fā)現(xiàn)14-3-3γ基因沉寂后，mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表達顯著下調，細胞活力和細胞數顯著下降，細胞分泌酪蛋白和