黏著斑激酶對肝星狀細胞細胞周期調(diào)控作用的研究.pdf

1、肝纖維化(hepaticfibrosis)是多種致病因子引起慢性肝病，進而發(fā)展為肝硬化的一個動態(tài)過程與共同病理途徑。肝星狀細胞(HSC)活化、增殖，進而合成大量的膠原等細胞外間質(zhì)(ECM)成分被認為是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。 HSC增殖受多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，粘著斑激酶(FAK)處于整合素、生長因子等信號通路的交匯點?；A(chǔ)研究表明，F(xiàn)AK磷酸化后，對多種類型細胞的生物學(xué)行為具有重要影響，如促進增殖，正性調(diào)控細胞周期，增強黏

2、附、遷移，誘導(dǎo)凋亡等。其第397酪氨酸位點(Tyr397)是自主磷酸化位點，該位點磷酸化后，可以順次激活其余磷酸化位點，放大FAK催化活性。因此，可以說，Tyr397是FAK發(fā)揮生物學(xué)功能的扳機點。 黏著斑激酶相關(guān)非激酶(FRNK)位于FAKC-末端，缺乏激酶區(qū)，包含黏著斑定位區(qū)(FAT)，可與FAK競爭粘著斑(FAP)上的結(jié)合位點，負向調(diào)控FAK的作用。 細胞增殖是通過細胞周期實現(xiàn)的。細胞周期蛋白D1(CyclinD1

3、)為細胞周期的始動因子，與細胞周期蛋白依賴激酶(CDK4/6)結(jié)合并激活后者，從而促進細胞發(fā)生G1/S期轉(zhuǎn)換。 張曉嵐等應(yīng)用膽總管結(jié)扎(BDL)大鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化發(fā)展，HSC大量活化增殖，F(xiàn)AK表達逐漸增強，且FAK與α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)明顯正相關(guān)，提示FAK有促HSC增殖作用。但迄今為止，F(xiàn)AK促HSC增殖機制國內(nèi)外均未見報道。為此，以CyclinD1與CDK4為切入點，有機結(jié)合整體和離體試驗，從細

4、胞周期角度探討FAK促HSC增殖的作用機制。實驗內(nèi)容包括以下兩部分： 第一部分：p-FAK(Tyr397)、CyclinD1與CDK4在膽汁淤積性大鼠肝纖維化形成過程中的動態(tài)表達 目的：探討膽汁淤積性大鼠肝纖維化形成過程中，p-FAK(Tyr397)、CyclinD1及CDK4含量的變化及其與HSC增殖的關(guān)系。 方法：采用BDL膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，將50只雄性SpragueDawley大鼠隨機分成假手術(shù)組

5、、1wk模型組、2wk模型組、3wk模型組與4wk模型組，共5組，每組10只。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動物，假手術(shù)組與4wk模型組同批麻醉。采用HE染色、Masson三色染色確定模型建立情況；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測定α-SMA表達；Westernblot及RT-PCR方法研究p-FAK(Tyr397)、CyclinD1與CDK4及其mRNA在肝纖維化不同時間肝組織中含量的動態(tài)變化。 結(jié)論：肝纖維化形成

6、過程中，HSC大量活化增殖，p-FAK(Tyr397)蛋白、CyclinD1與CDK4蛋白及其mRNA表達明顯增加；α-SMA、p-FAK(Tyr397)與CyclinD1、CDK4之間呈顯著正相關(guān)。FAK磷酸化促HSC增殖及肝纖維化形成機制可能與調(diào)控細胞周期蛋白有關(guān)。 第二部分：黏著斑激酶相關(guān)非激酶對FN刺激的肝星狀細胞細胞周期的影響 目的：探討應(yīng)用FRNK表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC，選擇性抑制FAK磷酸化，對FN誘導(dǎo)的HSC

7、細胞周期時相、CyclinD1與CDK4的影響，從細胞水平進一步證實FAK促HSC增殖的分子機制。 方法：應(yīng)用含2％胎牛血清、100IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1鏈霉素、4mmol·L-1谷氨酰胺及1mol·L-1HEPES的RMPI1640培養(yǎng)液，37℃、5％CO2條件下體外培養(yǎng)HSC。以FN刺激HSC增殖，根據(jù)Lipofectamine(R)Reagent提供的實驗步驟操作，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進行FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)

8、染。采用流式細胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞周期時相表達；Westernblot技術(shù)檢測FRNK、FAK、p-FAK(Tyr397)、CyclinD1與CDK4蛋白的表達情況；RT-PCR共擴增技術(shù)檢測CyclinD1、CDK4及內(nèi)參照β-actinmRNA表達變化。實驗分5組：①對照組；②FN組；③脂質(zhì)體組；④空質(zhì)粒組；⑤FRNK質(zhì)粒組。②～⑤組中FN濃度均為50μg·mL-1。 結(jié)論：體外細胞培養(yǎng)研究表明