惡性骨腫瘤側(cè)群(SP)細胞的分離,鑒定及生物學特性研究.pdf

1、惡性骨腫瘤起源于中外胚層的間葉組織，在臨床上總體發(fā)病率不高，但大都具有高度惡性，容易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，患者預后較差。近年來雖然手術方式及化療藥物在不斷改善，但收效甚微。造成這種現(xiàn)象最主要的原因是惡性骨腫瘤患者對目前的治療（主要是化療）不敏感。目前有關惡性骨腫瘤抗藥性和復發(fā)的調(diào)控機制我們還知之甚少，有人認為導致治療失敗的原因是惡性骨腫瘤中可能存在一小部分細胞具有某些干細胞特征（自我更新，高抗藥性，高侵襲性），從而最終導致腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。這個

2、觀點恰好與目前腫瘤研究領域中最前沿的腫瘤干細胞(cancerstemcell,CSC)理論相符合。腫瘤干細胞理論認為腫瘤中存在一小部分具有高抗藥性的細胞，這些細胞與正常成體干細胞一樣具有自我更新能力，能產(chǎn)生不同類型的后裔細胞以構(gòu)成腫瘤組織。該理論可以很好的解釋目前治療中腫瘤抗藥性和復發(fā)的原因，靶向治療腫瘤干細胞已引起人們極大地興趣。
　　盡管在很多類型的腫瘤中都已證實存在腫瘤干細胞，但有關惡性骨腫瘤的腫瘤干細胞研究卻鮮有報道。這可

3、能是到因為目前為止還沒有公認的惡性骨腫瘤特異性表面標志。不過干細胞的另一種特性（高效外排DNA染料Hoechst33342）也可以用來分離具有干細胞特征的細胞，采用此方法可以分離出一小部分側(cè)群（sidepopulation，SP）細胞?，F(xiàn)已在多種類型的腫瘤組織和細胞系中分離出SP細胞，并證實SP細胞具有許多與干細胞相似的特征，這些都提示SP細胞中富含腫瘤干細胞，但有關惡性骨腫瘤SP細胞研究卻很少有報道。
　　因此，我們選擇了人惡性

4、骨腫瘤中具有代表性的骨肉瘤和尤文氏肉瘤作為實驗對象，分別從細胞系和原代腫瘤組織中分離SP細胞并鑒定其各項生物學特性，希望可以證實惡性骨腫瘤SP細胞具有干細胞特征。
　　(一)骨肉瘤和尤文氏肉瘤SP細胞的分離
　　我們成功的在人尤文氏肉瘤細胞系SK-ES-1中找到并分離出SP細胞，SP細胞所占比例為約1.2％。而在人骨肉瘤細胞系MG63中無法找到SP細胞；但我們在骨肉瘤臨床標本中證實存在SP細胞，總共我們分析了6例標本，其中5

5、例都發(fā)現(xiàn)存在SP細胞（OS1-OS5），SP細胞比例從3.7％到10.2％。
　　(二)SP細胞與non-SP細胞各種生物學特性差異研究
　　1.再生細胞群能力
　　在體外SK-ES-1的SP細胞可以同時生成SP和non-SP細胞，而non-SP細胞只能分裂產(chǎn)生non-SP細胞；OS1-OS5的SP細胞在體內(nèi)和體外都可以同時生成SP和non-SP細胞，但non-SP細胞在體內(nèi)和體外生成大量non-SP細胞的同時也會產(chǎn)生

6、數(shù)量很少的SP細胞。
　　2.生長曲線
　　SK-ES-1的SP細胞群的生長曲線與non-SP細胞群的生長曲線在形狀上相似，二者都有對數(shù)生長期。并且SP細胞群和non-SP細胞群的分裂增殖速度并沒有明顯的差別；OS1-OS5的SP和non-SP細胞的生長曲線在形狀上與正常細胞的生長曲線類似，都具有對數(shù)生長期，但前3-4天non-SP細胞生長速度似乎要快于SP細胞。
　　3.體外克隆形成能力和侵襲性
　　SK-ES

7、-1和OS1-OS5的SP細胞都表現(xiàn)出明顯高于non-SP細胞的體外克隆形成能力，而non-SP細胞與未經(jīng)Hoechst33342染色的原始細胞的體外克隆形成能力沒有顯著的差別；同時我們也發(fā)現(xiàn)體外SK-ES-1SP細胞比non-SP細胞更具侵襲性。
　　4.裸鼠體內(nèi)成瘤能力
　　OS1和OS5的SP細胞在裸鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高致瘤性，同時non-SP細胞也表現(xiàn)出一定的致瘤性；但只有SP細胞具有自我更新能力：在連續(xù)移植實驗中只有SP

8、細胞能保持致瘤性，non-SP細胞無法成瘤，并且SP細胞的第二次異種移植瘤與原代腫瘤以及第一次異種移植瘤都具有相同的組織病理學細胞形態(tài)。
　　5.抗藥性
　　化療藥物阿霉素（doxorubicin）和順鉑（cisplatin）對SK-ES-1SP細胞的IC50明顯高于對non-SP細胞的IC50；阿霉素（doxorubicin），順鉑（cisplatin）和甲氨蝶呤（methotrexate）對OS1，OS2和OS5SP細胞

9、的IC50明顯高于對non-SP細胞的IC50（除OS1順鉑組，OS5順鉑和甲氨蝶呤組）。這些都提示SP細胞比non-SP細胞具有更高的化療藥物提抗性。
　　6.“干”性基因表達
　　通過RT-PCR分析我們發(fā)現(xiàn)SK-ES-1和OS1-OS5的SP細胞中ABC轉(zhuǎn)運家族基因表達上調(diào)，尤其是ABCG2，在所有檢測的SP細胞中全部高表達；此外，Oct-4和Nanog在OS1-OS5的SP細胞中表達也上調(diào)。
　　綜上所述，我們