Leptin對POMC及下丘腦-垂體軸的調節(jié).pdf

1、本實驗通過觀察leptin對下丘腦POMC（Proopiomelanocortin）神經元表達的影響以及對下丘腦-垂體軸激素分泌的調節(jié)作用，研究leptin對下丘腦-垂體軸的可能影響，初步探討leptin調控生殖的可能作用機理，為leptin的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 研究內容與結果如下：
　　 一、Leptin對POMC基因及蛋白水平的調節(jié)
　　 目的：觀察側腦室微量注射leptin對去卵巢給予一定量雌激素

2、補充的雌性大鼠下丘腦POMC基因及轉錄后水平的影響。
　　 方法：選用成年雌性Wistar大鼠制備OEP模型（ovariectomized，estrogen primed）。在無菌條件下行雙側卵巢切除術，術后從第8天開始每天皮下注射苯甲雌二醇25μg/只，注射5天后根據(jù)George Paxinos和Charles Watson編著的《The Rat Brain in stereotaxic coordinates》定位側腦室：以

3、Bregma點后1.0 mm，旁開1.5 mm，進針深4.0 mm，行側腦室微量注射。實驗組注射leptin5μl，對照組注射生理鹽水5μl；分別于微量注射后1h、2h、4h、6h以視交叉、乳頭體為前后界，下丘腦溝為側界，深約3mm左右為標準取下丘腦。迅速取出大鼠的下丘腦組織，稱重，在低溫下研磨制成勻漿，4℃3000rpm離心15min，取上清于-80℃保存。按照提取RNA的要求嚴格取下丘腦，置凍存管中保存于液氮中，依照Trizol的說

4、明提取下丘腦RNA。經過RNA的完整性檢測和定量，用RT-PCR的方法檢測微量注射后大鼠下丘腦組織POMC mRNA表達的變化。根據(jù)Western blot的實驗步驟，檢測大鼠下丘腦組織POMC蛋白表達的變化，并且對實驗結果進行統(tǒng)計分析。
　　 結果：1）大鼠下丘腦組織POMC mRNA的表達在側腦室微量注射leptin1h后有所增高，但與對照組相比沒有顯著性差異；在注射2h后POMC mRNA表達增高明顯，4h后：POMC m

5、RNA表達量達到高峰，與對照組相比有統(tǒng)計學差異；6h后POMC mRNA表達顯著降低，與對照組比較沒有統(tǒng)計學差異。2）側腦室微量注射leptin1h后，大鼠下丘腦組織POMC蛋白含量沒有變化，與對照組相比在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異；leptin注射2h后POMC蛋白含量開始增高，4h后POMC蛋白含量達到高峰，6h后POMC蛋白含量明顯降低，三組與對照組比較均具有明顯的統(tǒng)計學差異。
　　 結論：1）側腦室微量注射leptin后，對

6、下丘腦組織中的POMC mRNA表達的調節(jié)具有正向調節(jié)作用。2）側腦室微量注射leptin后，對下丘腦組織中的POMC蛋白表達具有正向調節(jié)作用。3）leptin可能通過POMC神經元對機體能量平衡與營養(yǎng)狀態(tài)起著調節(jié)作用。
　　 二、側腦室注射Leptin、α-MSH對下丘腦-垂體軸激素分泌的影響
　　 目的：采用側腦室微量注射leptin、α-MSH，觀察在注射后不同時間段對大鼠血漿GnRH、LH、FSH的影響，初步探討

7、POMC神經元對下丘腦-垂體-生殖軸的調節(jié)作用。
　　 方法：選用成年清潔級雌性Wistar大鼠，隨機分為對照組、Leptin組、α-MSH組。在無菌條件下行雙側卵巢切除術，制作OEP大鼠模型。Leptin組注射leptin5μl，α-MSH組注射α-MSH5μl，對照組注射生理鹽水5μl，于1min內注入側腦室。分別于微量注射后1h、2h、4h和6h在麻醉狀態(tài)下開胸，從右心房采集靜脈血，離心后取上層血漿，在-20℃下儲存?zhèn)錅y。

8、本實驗采用ELISA酶免試劑盒進行血漿激素檢測。
　　 結果：1）側腦室注射Leptin后1h，大鼠血漿GnRH濃度與對照組相比明顯增高，注射后2h，血漿GnRH濃度達到高峰。注射后4h，GnRH濃度迅速回落至1h時濃度以下，但仍較對照組濃度高。1h、2h、4h時GnRH濃度與對照組相比有統(tǒng)計學差異；Leptin注射后6h時，血漿GnRH濃度已恢復到對照組水平，與對照組之間沒有統(tǒng)計學差異。2）側腦室微量注射Leptin后1h，大

9、鼠血漿LH濃度與對照組相比明顯增高，注射Leptin后2h，血漿LH濃度繼續(xù)增高并達到高峰。在4h時，LH濃度下降，但與對照組相比仍維持在較高水平。1h、2h、4h時的濃度與對照組相比具有統(tǒng)計學差異；在注射Leptin6h后，LH濃度與對照組相比，沒有明顯的統(tǒng)計學差異。3）側腦室注射Leptin后1h，大鼠血漿FSH分泌有所增多，但與對照組比較沒有統(tǒng)計學差異；2h時FSH血漿濃度迅速升高并達到高峰，4h時FSH濃度明顯降低。2h、4h時

10、的FSH濃度與對照組相比具有統(tǒng)計學差異；在注射Leptin6h后，F(xiàn)SH濃度與對照組相比，沒有明顯的統(tǒng)計學差異。4）側腦室注射α-MSH后1h，大鼠血漿GnRH濃度降低，與對照組相比具有明顯的統(tǒng)計學差異；注射2h后，血漿GnRH濃度繼續(xù)降低，與對照組相比具有顯著性統(tǒng)計學差異；在4h和6h時，GnRH濃度與對照組相比，沒有明顯的統(tǒng)計學差異。5）側腦室注射α-MSH后1h，大鼠血漿LH濃度明顯降低，2h時LH濃度繼續(xù)降低，4h時LH濃度回升

11、，較1h時濃度為高，6h時LH濃度恢復正常。注射α-MSH后LH濃度在1h、2h和4h時與對照組比較具有統(tǒng)計學差異；在6h時，LH濃度與對照組相比，沒有明顯的統(tǒng)計學差異。6）側腦室注射α-MSH后1h，大鼠血漿FSH濃度略有降低，與對照組相比，沒有明顯的統(tǒng)計學差異；2h時FSH濃度明顯降低，4h時FSH濃度回升，6h時FSH濃度恢復正常。注射α-MSH后FSH濃度在2h和4h時與對照組比較具有統(tǒng)計學差異；在6h時，F(xiàn)SH濃度與對照組相比

12、，沒有明顯的統(tǒng)計學差異。
　　 結論：1）微量注射Leptin對去卵巢給予雌激素補充的雌性大鼠GnRH、LH、FSH分泌具有正向調節(jié)作用。2）微量注射僅.MSH對去卵巢給予雌激素補充的雌性大鼠GnRH、LH、FSH分泌具有負向調節(jié)作用。
　　 三、Leptin、α-MSH對體外培養(yǎng)的大鼠垂體細胞LH、FSH分泌的影響
　　 目的：通過leptin、α-MSH對體外培養(yǎng)的大鼠垂體前葉（AP）細胞分泌LH、FSH的影

13、響，初步探討leptin、α-MSH在垂體水平對生殖功能的調節(jié)作用。
　　 方法：實驗動物是清潔級成熟雌性Wistar大鼠，給予腹腔麻醉，酒精消毒大鼠頭皮，用手術刀將頭皮撥開，暴露顱骨，用止血鉗將頭蓋骨剝離暴露大腦，快速取出大腦，并用眼科鑷子取出靠近腦干部位的腦垂體，放入盛有D-Hanks平衡鹽溶液的玻璃培養(yǎng)皿中。去除神經垂體，保留腺垂體。用眼科剪將漂洗好的腺垂體剪成<1mm3大小的腺垂體塊，經過消化、離心、過濾、活細胞計數(shù)、培

14、養(yǎng)，觀察細胞生長情況。于培養(yǎng)的第4天，在培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的leptin、α-MSH，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取各組培養(yǎng)液，于-20℃儲存，用酶免試劑盒對各組培養(yǎng)液中的LH、FSH含量作檢測。
　　 結果：1）接種細胞最初為圓形，形態(tài)完整，6h內開始貼壁，24h內一些細胞開始長出突起，48h細胞貼壁良好，出現(xiàn)不規(guī)則的聚集生長。垂體前葉細胞呈現(xiàn)橢圓形、三角形或多角形，呈典型的上皮樣細胞。在培養(yǎng)的7d內，腺細胞在形態(tài)上除了增大外，幾

15、乎沒有明顯的改變。從培養(yǎng)的第5d起，另一群細胞開始日漸明顯，數(shù)量逐漸增多，并向成纖維細胞方向發(fā)展。7d成纖維細胞開始過度生長，而腺細胞開始失去了原有形態(tài)特點，到第10d時，基本被成纖維細胞取代。2）在leptin的刺激下，LH的釋放量隨leptin濃度的增高而增加，當leptin濃度達到10-9 mol/L時，LH釋放量達到高峰，之后隨leptin濃度的增加LH的釋放量反而降低。除當leptin濃度為1×10-12mol/L時，LH的釋

16、放量與對照組比較，沒有顯著差異外，其他各組LH的釋放量與對照組比較，均有顯著差異。不同leptin濃度組之間比較，均有顯著差異。3）在leptin的刺激下，F(xiàn)SH的釋放量隨leptin濃度的增高亦增高。當leptin濃度達到1×10-9mol/L時，F(xiàn)SH釋放量達到高峰，之后隨leptin濃度的增加FSH的釋放量反而減少。除當leptin濃度為1×10-12和1×10-6mol/L時，F(xiàn)SH的釋放量與對照組比較，沒有顯著差異外，其他各組

17、FSH的釋放量與對照組比較，均有顯著差異。不同leptin濃度組之間比較，除1×10-12mol/L組和1×10-6mol/L組兩組之間沒有顯著性差異外，各組之間均有顯著差異。4）在α-MSH的刺激下，LH、FSH釋放量與對照組比較沒有顯著性差異，不同α-MSH濃度組之間LH、FSH釋放量比較也沒有顯著性差異。
　　 結論：1）體外培養(yǎng)的垂體細胞6h內開始貼壁，24h內一些細胞開始長出突起，48h細胞貼壁良好，開始聚集成團。從第

18、5d起，另一群細胞開始日漸增多，并向成纖維細胞方向發(fā)展。在培養(yǎng)的7d內，腺細胞在形態(tài)上除了增大外，幾乎沒有明顯的改變。此時成纖維細胞開始過度生長，而腺細胞開始失去了原有形態(tài)特點。培養(yǎng)的垂體細胞最初為圓形，進而呈橢圓形、三角形或多角形。到第10d時，基本被成纖維細胞取代。2）Leptin對培養(yǎng)的腺垂體細胞LH、FSH的分泌均有影響，當Leptin濃度為10-9mol/L對LH、FSH的分泌可產生最大效應。Leptin濃度增高或降低作用均減