定位于人類17號染色體上新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA-ncRNA基因的鑒定及其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中作用研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文定位于人類17號染色體上新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA-ncRNA基因的鑒定及其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中作用研究姓名：于萌申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：于秉治20090401人1 7 號染色體上的長的非編碼R N A ，并在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中具有癌基因的特性。實驗方法一、 臨床資料收集的神經(jīng)母細(xì)胞腫瘤樣本來自日本多個醫(yī)療機構(gòu)，經(jīng)手術(shù)或是送檢而得。2 3 6 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤樣本用于比較基因組雜交技術(shù)分析，1 3 6 例樣本

2、用于基因表達(dá)譜的分析，其中各有1 1 2 例和7 0 例散發(fā)病例。臨床標(biāo)本根據(jù)國際神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期系統(tǒng)( I N S S ) 進行分類。7 0 例散發(fā)病例中臨床I 期1 5 例，I I 期8 例，I I I 期1 7例，Ⅳ期2 5 例，I V s 期5 例，該樣本的表達(dá)分析用于K a p l a n ．M e i e r 生存曲線分析。本病例中相對應(yīng)的M Y C N 擴增情況已在發(fā)表文章中報道。二、 方法1 、比較基因組雜交技術(shù)( a

3、r r a y ．C G H ) 和表達(dá)譜基因芯片技術(shù)利用包涵整個人類基因組的2 4 6 4 個細(xì)菌人工染色體( B A C ) 克隆的生物芯片，對2 3 6 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤進行比較基因組雜交技術(shù)分析，分辨率小于1 ．2 M b 。從臨床分期不同的神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織提取R N A ，通過o l i g o - c a p p i n g 法建立c D N A 文庫獲得5 3 4 0 個e D N A ，對1 3 6 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤進行基因

4、表達(dá)譜分析，該芯片僅限于日本千葉癌中心研究局的相關(guān)神經(jīng)母細(xì)胞瘤研究。比較基因組雜交( a r r a y - C G H )和表達(dá)譜基因芯片的相關(guān)數(shù)據(jù)可以登錄美國國家生物技術(shù)信息中心( N C B I ) 高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫( h t t p ：／／w w w ．n c b i ．n l m ．n i h ．g o v ／g e o ／) 進行查詢。相應(yīng)數(shù)據(jù)庫編號分別為G S E 5 7 8 4 和G S E 5 7 7 9 。2 、

5、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含1 0 ％滅活胎牛血清及抗生素的D M E M 培養(yǎng)基或是R P M l l 6 4 0 培養(yǎng)基對N I H 3 T 3 和C O S 7 以及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進行培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為3 7 “ C ，C 0 2 分壓為5 ％的細(xì)胞培養(yǎng)箱。根據(jù)廠家說明，用L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n ) 進行C O S 7 和N I H 3 T 3 細(xì)胞