囊泡膜結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白VAP33對(duì)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞肉瘤生物學(xué)特性的影響.pdf

1、侵襲性和轉(zhuǎn)移性是惡性腫瘤最重要的特征，也是腫瘤患者死亡的主要原因，目前已證實(shí)腫瘤轉(zhuǎn)移是基因調(diào)控下的多階段、多因素、多步驟的過(guò)程，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究雖然有了長(zhǎng)足的發(fā)展，但其分子機(jī)制遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有闡明。因此研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程高度相關(guān)的基因，深入了解這些基因在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及機(jī)制仍是研究熱點(diǎn)。
　　 囊泡膜結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白VAP33是一類(lèi)特殊的蛋白，分為VAPA，VAPB，VAPC三個(gè)亞型，通過(guò)與VAMP(vesicleas

2、sociatedmembraneprotein)結(jié)合發(fā)揮囊泡運(yùn)輸作用。本實(shí)驗(yàn)室前期工作，在基因和蛋白水平證實(shí)VAP33的表達(dá)程度跟腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)[1-3]；Pastric.S也發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移癌組織較原發(fā)癌中VAPA高表達(dá)[4]。作為一種調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸?shù)牡鞍祝琕AP33在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)及腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究在參考前期工作及相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討VAP33在腫瘤惡性行為發(fā)生中的作用。
　　 本研究采用

3、了具有低轉(zhuǎn)移特性的兩個(gè)細(xì)胞株：小鼠樹(shù)突狀肉瘤細(xì)胞DG6和小鼠肺腺癌細(xì)胞LA1作為體外模型，通過(guò)建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)VAP33蛋白的細(xì)胞株(DG6-VAP33、LA1-VAP33)來(lái)觀察細(xì)胞的變化。
　　 首先，本研究構(gòu)建了表達(dá)VAP33-GFP融合蛋白的表達(dá)載體、建立了DG6-VAP33和LA1-VAP33細(xì)胞株。根據(jù)GeneBank中VAP33的mRNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在正反引物的5’端分別加入PmeI和MluI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基

4、。通過(guò)RT-PCR技術(shù)從DCS細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增出VAP33，利用基因重組技術(shù)，將目的基因克隆到載體pWPXL的PmeI/MluI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組載體，經(jīng)測(cè)序該載體構(gòu)建成功．之后本研究采用慢病毒包裝技術(shù)，將重組病毒質(zhì)粒(pWPXL-VAP33)與兩種包裝質(zhì)粒(PsPAX2、MD2G)在脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞），包裝出重組慢病毒，分別以不同的MOI值感染目的細(xì)胞。通過(guò)熒光顯微鏡

5、挑選，WB鑒定獲得VAP33穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株(DG6-VAP33和LA1-VAP33)。
　　 接下來(lái)本研究又觀察VAP33過(guò)表達(dá)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 本研究檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞在形態(tài)、體積、增殖、集落形成、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力方面的改變，同時(shí)設(shè)立DG6、LA1細(xì)胞為對(duì)照組。細(xì)胞分析計(jì)數(shù)儀CasyTT檢測(cè)細(xì)胞大小，DG6和DG6-VAP33細(xì)胞的平均直徑分別為16.58μm和15.79μm，細(xì)胞大小無(wú)明顯變化；核漿

6、比分別為1∶4.66(DG6)和1∶3.99(DG6-VAP33)；通過(guò)顯微鏡觀察，過(guò)表達(dá)前后的DG6細(xì)胞形態(tài)也無(wú)明顯變化；DG6-VAP33和LA1-VAP33集落數(shù)分別為（36±5）個(gè)/孔和（21±3）個(gè)/孔，低于其對(duì)照組（52±8）個(gè)/孔和（28±4）/孔，P＜0.05，說(shuō)明VAP33抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖能力；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示VAP33與DG6細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有明顯關(guān)系；transwell方法觀察到，DG6-VAP33細(xì)胞體外侵襲能

7、力顯著下降，穿膜細(xì)胞數(shù)(28±22)少于DG6(72±34)，P＜0.01，而LA1-VAP33體外侵襲能力無(wú)明顯改變，說(shuō)明VAP33與腫瘤細(xì)胞侵襲能力的關(guān)系需更多實(shí)驗(yàn)研究確定。以上結(jié)果說(shuō)明，VAP33過(guò)表達(dá)降低了腫瘤細(xì)胞的體外增殖能力。
　　 為進(jìn)一步明確過(guò)表達(dá)VAP33在體內(nèi)水平上對(duì)惡性腫瘤的作用，本研究建立了小鼠皮下移植瘤模型，觀察該蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖、成瘤、轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，DG6-VAP33組腫瘤生長(zhǎng)速度顯