細(xì)胞復(fù)制性衰老及過氧化氫誘導(dǎo)早衰過程中表觀遺傳學(xué)調(diào)控.pdf

1、1研究背景: 細(xì)胞不斷經(jīng)受內(nèi)源性和外源性的各種應(yīng)激和損傷，體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞具有一定的增殖能力，經(jīng)過一系列傳代之后，逐漸變得衰老，即細(xì)胞復(fù)制性衰老。氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致DNA損傷或干擾異染色質(zhì)，因而誘導(dǎo)早期傳代的細(xì)胞過早衰老，即應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰。過氧化氫可短期內(nèi)作用于細(xì)胞獲得氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的早衰。細(xì)胞復(fù)制性衰老與應(yīng)激誘導(dǎo)的早衰具有相似的衰老表型，如細(xì)胞變大扁平，伴隨有核和核仁的體積增大，失去細(xì)胞與細(xì)胞間接觸，衰老相關(guān)β-半乳糖苷

2、酶表達(dá)等等，而兩者具體的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制可能存在差異。細(xì)胞衰老的機(jī)制可能是人類衰老及衰老相關(guān)性疾病的分子基礎(chǔ)。 延緩衰老及治療衰老相關(guān)性疾病是人類最大的夢想之一，目前對于衰老機(jī)制的認(rèn)識仍很局限。近來研究表明，表觀遺傳學(xué)，也稱外遺傳學(xué)，是研究機(jī)體發(fā)育及細(xì)胞增殖過程中基因表達(dá)調(diào)控的改變，這些改變可受環(huán)境因素的影響，其修飾的改變可能是細(xì)胞衰老一個(gè)決定性因素。表觀遺傳學(xué)修飾包括DNA甲基化和組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾，即組蛋白甲基化、乙?；土姿峄?/p>

3、修飾，ATP依賴的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑。然而，在表觀遺傳學(xué)和細(xì)胞及器官衰老方面的研究資料尚較匱乏，這可能跟衰老本身的復(fù)雜性有關(guān)。目前有限的資料表明，DNA甲基化可能修飾一些衰老相關(guān)調(diào)控基因，隨著年齡增加，這種修飾作用減弱或增強(qiáng)，確定這些改變是隨機(jī)的或“程序性”的，及是否受環(huán)境氧化應(yīng)激的影響十分重要。組蛋白H3和H4N末端共價(jià)修飾可促進(jìn)染色質(zhì)重建，組蛋白修飾及其不同組合參與基因轉(zhuǎn)錄的活化或沉默。 衰老是內(nèi)、外因素共同作用的結(jié)果，是一種多

4、基因的復(fù)合調(diào)控過程，但衰老的始動(dòng)因素及其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍有待探究。表觀遺傳學(xué)修飾可能提供了細(xì)胞衰老所需的表觀微環(huán)境，如果能通過此途徑揭示衰老的分子機(jī)制，且找到延緩衰老進(jìn)程的方法，將具有重大的生物學(xué)意義和臨床應(yīng)用前景。 本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)的人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞為研究對象，檢測正常細(xì)胞復(fù)制性衰老及過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰過程中表觀遺傳學(xué)調(diào)控的作用，包括全基因組DNA甲基化、整體的組蛋白乙?；凹谆兓?；表觀遺傳學(xué)相關(guān)酶的表達(dá)變化及

5、其活性改變；衰老相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)變化及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域DNA甲基化改變和組蛋白修飾狀況；并尋找正常年輕細(xì)胞及復(fù)制性衰老細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域未知的差異甲基化基因，為細(xì)胞衰老過程中表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用提供理論依據(jù)。 2材料與方法: 2.1建立細(xì)胞復(fù)制性衰老及過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰模型建立體外培養(yǎng)的正常人胚肺成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老模型及400μM過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰模型，觀察在細(xì)胞正常復(fù)制性衰老及早衰過程中，細(xì)胞的一般生

6、物學(xué)特性改變，包括細(xì)胞形態(tài)，生長曲線，壽命周期，細(xì)胞周期分布及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)的變化。 2.2檢測基因組DNA甲基化調(diào)控以5-甲基胞嘧啶抗體免疫熒光方法及[3H]甲基摻入法檢測人胚肺成纖維細(xì)胞基因組DNA整體甲基化變化趨勢；基于ELISA樣反應(yīng)方法檢測甲基轉(zhuǎn)移酶總的活性改變；并以Q-PCR和WesternBlot方法檢測甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基化結(jié)合蛋白mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，同時(shí)觀察了5-氮雜胞苷對各甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基化

7、結(jié)合蛋白表達(dá)的影響。 2.3組蛋白整體乙?；c甲基化調(diào)控以相應(yīng)抗體的細(xì)胞免疫熒光方法觀察組蛋白H3，H4整體乙?；厔菁敖M蛋白H4(Lys20)整體甲基化趨勢的改變；基于ELISA樣反應(yīng)方法檢測組蛋白總體去乙?；傅幕钚宰兓徊⒁訯-PCR方法檢測乙?；傅膍RNA表達(dá)，以Q-PCR方法和WesternBlot方法檢測去乙?；傅膍RNA和蛋白水平的表達(dá)，同時(shí)觀察曲古霉素A對乙?；负腿ヒ阴；副磉_(dá)的影響。 2.4檢測衰

8、老相關(guān)基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況以Q-PCR方法檢測P53，PI6，IGF2，P66，F(xiàn)OXA2的mRNA表達(dá)水平；在亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA的基礎(chǔ)上，以甲基化特異性PCR檢測上述基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀況；同時(shí)對年輕細(xì)胞，復(fù)制性衰老細(xì)胞及早衰細(xì)胞組的P66，F(xiàn)OXA2啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島進(jìn)行克隆測序，全面觀察其CpG島甲基化修飾狀況。 2.5衰老相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的組蛋白乙?；凹谆揎椧匀旧|(zhì)免疫沉淀結(jié)合定量PC

9、R的方法檢測年輕細(xì)胞，中年細(xì)胞，復(fù)制性衰老細(xì)胞及早衰細(xì)胞組P53，P16，IGF2，P66，F(xiàn)OXA2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的組蛋白修飾情況，包括組蛋白H3，H4乙?；揎椉敖M蛋白H3(Lys4)，H4(Lys20)的甲基化修飾狀況。 2.6檢測年輕細(xì)胞及復(fù)制性衰老細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域CpG島差異表達(dá)基因以甲基化的DNA免疫沉淀結(jié)合基因芯片技術(shù)檢測年輕細(xì)胞及復(fù)制性衰老細(xì)胞啟動(dòng)子及第一外顯子區(qū)域CpG島差異表達(dá)的基因，并進(jìn)行兩組細(xì)胞差異的甲

10、基化基因感興趣分類。 3結(jié)果: 3.1細(xì)胞復(fù)制性衰老與細(xì)胞早衰具有相同的形態(tài)學(xué)特征和增殖能力體外培養(yǎng)的正常人胚肺成纖維細(xì)胞于52PDL進(jìn)入不可逆的復(fù)制性衰老狀態(tài)，依據(jù)細(xì)胞的群體倍增水平(PDL)，分為22PDL(年輕細(xì)胞組)，35PDL(中年細(xì)胞組)和49PDL(復(fù)制性衰老細(xì)胞組)。同步培養(yǎng)的22PDL人胚肺成纖維細(xì)胞，以400μMH2O2連續(xù)染毒4次，每天1次，每次2h，染毒后繼續(xù)培養(yǎng)7天，細(xì)胞呈現(xiàn)不可逆的早衰狀態(tài)，分

11、為早衰起始組和早衰持續(xù)組。復(fù)制性衰老及早衰細(xì)胞處于衰老狀態(tài)后均可維持存活1個(gè)月以上，細(xì)胞變大扁平，飽和度降低。復(fù)制性衰老模型中各組細(xì)胞群體倍增時(shí)間為22PDL48h，35PDL52h，49PDL96h。細(xì)胞早衰模型中，4次染毒期間，細(xì)胞均有不同程度的增殖，染毒4次后，細(xì)胞幾乎停止增殖，處于明顯的不可逆早衰狀態(tài)。復(fù)制性衰老的細(xì)胞壽命周期為110天，早衰的為50天。細(xì)胞周期分布中G1％分別為22PDL35.5％，35PDL72.6％和49P

12、DL89.5％及早衰起始組61.6％，早衰持續(xù)組77.2％：細(xì)胞增殖指數(shù)隨增齡呈現(xiàn)降低的變化趨勢。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率分別為22PDL5.1％，35PDL15.7％和49PDL90.7％及衰老起始組43.8％，衰老持續(xù)組91.3％。 3.2衰老的細(xì)胞呈現(xiàn)較低的基因組DNA甲基化水平，復(fù)制性衰老與早衰甲基化調(diào)控存在差異甲基化免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中，基因組DNA甲基化水平逐漸降低；染毒組細(xì)胞早衰過

13、程中，基因組DNA甲基化水平也逐漸降低；【3H]甲基摻入實(shí)驗(yàn)得到一致的結(jié)果，甲基化的CpG％分別為22PDL68.2％，35PDL41.9％和49PDL16.1％及早衰起始組63.5％，早衰持續(xù)組18.0％。復(fù)制性衰老及早衰的細(xì)胞都呈現(xiàn)出明顯的低甲基化水平。 3.3衰老的細(xì)胞呈現(xiàn)整體組蛋白H3，H4低乙酰化及H4K20高甲基化水平，復(fù)制性衰老與早衰組蛋白修飾調(diào)控存在差異細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞衰老過程中，與年輕細(xì)胞相比，組蛋白

14、H3，H4整體乙?；厔葜饾u降低，早衰起始組略低于中年細(xì)胞組，早衰持續(xù)組同復(fù)制性衰老細(xì)胞組；組蛋白H4(Lys20)整體甲基化趨勢，復(fù)制性衰老細(xì)胞組升高，早衰持續(xù)組同復(fù)制性衰老細(xì)胞組。 3.4細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控有不同程度關(guān)聯(lián)在細(xì)胞衰老過程中，與年輕細(xì)胞組mRNA表達(dá)水平相比，復(fù)制性衰老細(xì)胞組P53表達(dá)升高，中年細(xì)胞組顯著升高，而早衰持續(xù)組無明顯變化；中年細(xì)胞組P16表達(dá)降低，而復(fù)制性衰老細(xì)胞組明

15、顯升高，早衰持續(xù)組也升高：中年細(xì)胞組及復(fù)制性衰老細(xì)胞組IGF2表達(dá)升高，早衰持續(xù)組顯著升高；中年細(xì)胞組及復(fù)制性衰老細(xì)胞組P66表達(dá)升高，早衰持續(xù)組升高顯著：復(fù)制性衰老細(xì)胞組及早衰持續(xù)組FOXA2表達(dá)均明顯降低。 4結(jié)論: 4.1獲得人胚肺成纖維細(xì)胞體外復(fù)制性衰老模型及成功建立穩(wěn)定的過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞早衰模型，細(xì)胞復(fù)制性衰老與細(xì)胞早衰具有相同的形態(tài)學(xué)特征和增殖能力。 4.2基因組DNA低甲基化，整體組蛋白H3，H4低

16、乙?；虷4K20高甲基化狀態(tài)是細(xì)胞衰老發(fā)生的表觀微環(huán)境，表觀遺傳學(xué)相關(guān)酶的表達(dá)與活性改變參與其形成與維持。 4.3在細(xì)胞衰老過程中，特異基因表達(dá)發(fā)生變化，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域特定的DNA甲基化和組蛋白修飾參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 4.4細(xì)胞復(fù)制性衰老與細(xì)胞早衰的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制存在差異，氧化應(yīng)激可能通過表觀遺傳學(xué)修飾的變化作用于細(xì)胞早衰的發(fā)生。 4.5獲得人胚肺成纖維細(xì)胞年輕階段及復(fù)制性衰老階段轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域高甲基化的特