聯合應用DNA免疫和細胞加強制備CD55單克隆抗體及抗體生物學活性分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、實驗目的：用DNA免疫和細胞加強方法制備抗人CD55分子單克隆抗體(Mab)，并對其生物學特性進行初步研究，確定該方法制備抗體的可行性。 實驗方法：RT-PCR方法克隆CD55分子編碼區(qū)全長基因，將擴增基因定向導入真核表達載體pcDNA3.1和原核表達載體pET28a中。誘導pET28a/55載體在大腸桿菌Rosseta中表達CD55，表達產物以包涵體形式存在。通過鹽酸胍變性溶解包涵體，并經鎳柱純化得到重組CD55蛋白。重組質粒

2、pcDNA3.1/55采用多次肌肉注射方法免疫小鼠，并在每次DNA免疫前對小鼠股四頭肌做預處理①DNA免疫前1周注射蛇毒心肌毒素；②DNA免疫前15分鐘注射25％的高滲蔗糖溶液。與細胞融合前3天，用高表達CD55分子HPB-ALL細胞加強免疫一次，之后采用傳統(tǒng)的淋巴細胞雜交瘤技術制備抗CD55分子單克隆抗體。通過流式細胞術檢測每次免疫后小鼠血清中抗體分泌情況。應用夾心ELISA方法檢測抗體的類型，并利用抗體競爭實驗初步驗證制備抗體的表位

3、。通過流式細胞儀(FACS)、熒光顯微鏡驗證抗體與天然細胞膜蛋白的結合活性和特異性；Westernblot印證抗體與變性線性蛋白結合活性。 實驗結果： (1)擴增CD55全長基因1174bp，構建成pcDNA3.1/55重組質粒。 (2)采用FACS檢測血清滴度，3次DNA免疫后其最高為1∶200，細胞加強后滴度最高為1∶800。 (3)通過細胞融合、篩選和克隆化培養(yǎng)最后得到兩株單克隆抗體分別為2B6E和

4、2B6B。 (4)兩株抗體IgG亞類均為IgG2a，輕鏈均為為κ型。 (5)抗體免疫競爭實驗表明2B6B、2B6E、IA10(BD)和67(Serotec)之間識別不同的抗原表位。 (6)FACS、免疫熒光顯微鏡和Westernblot實驗表明抗體與天然細胞膜蛋白和變性膜蛋白及重組蛋白都有良好的結合活性和特異性。 實驗結論：pcDNA3.1/55肌肉內免疫后能激發(fā)小鼠產生針對CD55分子的抗體，聯合應用細

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