豬腦心肌炎病毒基因組分子特征及其全長感染性cDNA克隆的構(gòu)建.pdf

1、腦心肌炎病毒(Eneephalomyoearditis virus，EMCV)屬于微RNA病毒科(Picornaviridae)，心病毒屬(Cardiovirus)成員。腦心肌炎病毒感染可致母豬繁殖障礙和仔豬的高死亡率，以腦炎、心肌炎和心肌周圍炎為主要特征。本研究完成了2株我國EMCV分離毒株(BJC3和HB1)的全基因組序列測定和基因組分子特征分析，獲得了我國EMCV毒株的基因組信息數(shù)據(jù)，為EMCV的分子流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究奠定了

2、基礎(chǔ)；成功構(gòu)建了EMCV分離毒株BJC3的全長感染性cDNA克隆，為深入研究EMCV的分子致病與免疫機理、基因功能和新型病毒載體的構(gòu)建及其新型疫苗的研制提供了必要的技術(shù)平臺。 通過設(shè)計5對引物，采用RT-PCR技術(shù)擴增EMCV分離毒株BJC3和HBl基因組完整開放閱讀框(ORF)序列，應(yīng)用3'RACE和5'RACE技術(shù)擴增分離毒株的3'UTR和5'UTR，分別進行擴增片段的克隆和測序。結(jié)果表明，排除poly(A)，BJC3和HB

3、l的全基因組大小分別為773Int和7720nt，它們的基因組結(jié)構(gòu)相同，全基因組核苷酸序列相似性為99.6％；具有一個長的開放閱讀框，編碼2292aa。BJC3和HB1，的poly(C)結(jié)構(gòu)域中均存在C<,n>TCTC<,3>TC<,10>保守基序，BJC3的poly(C)至少由26nt組成，HB 1的poly(C)可讀序列不少于24nt。BJC3和HB1的poly(A)尾都比較短，僅15個腺嘌呤核苷。 應(yīng)用分子生物學(xué)軟件對BJ

4、C3和HB1全基因組核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列進行了序列比對和同源性分析。結(jié)果表明，2個分離毒株基因組核苷酸的變異程度不大，核苷酸變異散在分布于基因組的各個編碼區(qū)，BJC3和HB1與其它EMCV參考毒株全基因組核苷酸序列同源性介于83.6％～99.9％，與CBNU的全基因組核苷酸序列同源性最高，分別為99.9％和99.7％；與EMC-B全基因組核苷酸序列同源性最低，均為83.6％。BJC3和HB1與Mengo病毒全基因組核苷酸序列同源性均為

5、81.3％。BJC3和HB1的VP1核苷酸序列同源性為99.5％，BJC3 VP1核苷酸序列與其它EMCV參考株的同源性介于81.5％～99.5％。BJC3、HB1、BEL-2887A/91和CBNU的VP4、VP2、2B和3B氨基酸序列高度保守，同源性均為100％。BJC3和HB1 VP1蛋白有2個潛在的N-糖基化基序，分別為N<,29>QT和N<,62>GT，VP1是表位最多的區(qū)域，預(yù)測有9個可能的表位；位于VP3“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)處的

6、表位基序T<,17>LPDST和E<,40>YKDFL及VP1的P<,27>ENQTK可能是EMCV的中和表位。基于EMCV完整ORF推導(dǎo)氨基酸序列繪制的系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，BJC3和HB1在相同的進化分支上，它們與歐洲流行毒株BEL-2887A/91的進化關(guān)系較近，可能有共同的起源。 依據(jù)BJC3全基因組序列，設(shè)計2對引物擴增其5'半長cDNA和3'半長cDNA，依次連接至低拷貝質(zhì)粒pWSK29，構(gòu)建出BJC3全長cDNA克隆

7、(pWSKBJC3/W)。經(jīng)測序顯示，該全長質(zhì)粒5'末端成功引入SP6原核啟動子，3'末端poly(A)長度22nt，poly(C)長度為25nt。pWSKBJC3/W全長質(zhì)粒經(jīng)Not Ⅰ酶切線化、體外轉(zhuǎn)錄，得到具有感染性EMCV RNA，經(jīng)脂質(zhì)體DMRIE-C轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，36h收獲培養(yǎng)上清，連續(xù)傳3代，細胞出現(xiàn)CPE。經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光鑒定，證實獲得具有感染性的恢復(fù)病毒，命名rBJC3/SP6。第5代恢復(fù)病毒rBJ