PLKs介導神經元細胞周期阻滯和朊病毒清除的機制研究.pdf

1、朊病毒是一種可感染人和動物中樞神經系統(tǒng)的傳染性蛋白質，其引起的疾病包括人的克雅氏病、庫魯病、吉斯曼綜合征、致死性家族失眠癥以及動物的羊瘙癢癥、瘋牛病等，死亡率達100％。目前普遍認為其致病原因是具有正常生理結構的朊蛋白PrPC在未知因素誘導下發(fā)生異常折疊轉變?yōu)榫叩鞍酌缚剐缘闹虏‰玫鞍譖rPSc。在朊病毒感染的早期階段，異常折疊的PrPSc蛋白可激發(fā)多種應激反應引起神經元的損傷，同時被感染的神經元試圖通過自噬或凋亡的方式以達到清除PrPS

2、c的目的;在感染的晚期階段，由于大量的PrPSc蛋白無法被及時清除，引起的神經毒性造成了一系列的病理學改變，如神經元的死亡、星型膠質和小膠質細胞的增生、淀粉樣斑塊沉積和腦組織內空泡樣變性等。
　　盡管目前對朊病毒引起神經元死亡的機制已有一定了解，但其詳細的機制尚未闡明。長期以來的研究認為成熟的神經元屬于終末分化的細胞，處于不可分裂的狀態(tài)，無法越過G0期而進入細胞周期。然而近年來的研究表明在阿爾茲海默癥(Alzheimer's di

3、sease，AD)和帕金森癥(Parkinson's disease，PD)等中樞神經系統(tǒng)退行性疾病患者的腦組織切片中檢測到神經元中上調表達的細胞周期蛋白，因此科學家們提出了中樞神經元可在某種因素的誘導下重新進入細胞周期的假說，并在AD、PD和朊病毒病的細胞模型中證實了這一假說。Polo樣激酶(Polo-like kinases，PLKs)是廣泛存在于真核生物中的一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細胞周期的各個關鍵點發(fā)揮多種精密的調控作用，如中

4、心體的復制、成熟、有絲分裂的進入和姐妹染色體的分離等。目前已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)五種PLK，其中PLK1的上調和PLK3的下調表達與多種惡性腫瘤的發(fā)展及不良預后相關。除了在細胞周期中發(fā)揮作用之外，PLK2/3還參與中樞神經系統(tǒng)突觸可塑性的調節(jié)。
　　由于朊病毒病中存在神經元細胞周期再進入事件，而PLK1/3在細胞周期G2/M期轉化過程中發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用，我們前期的基因芯片轉錄譜分析發(fā)現(xiàn)在朊病毒病患者腦組織中PLK1上調，而PLK3下

5、調，因此我們建立這樣的假說:“朊病毒病中PLKs參與調控神經元細胞周期阻滯”。本研究利用朊病毒感染的細胞模型和動物模型，通過免疫組織化學、免疫印跡等技術探討了PLKs在朊病毒病病程中的變化規(guī)律，分析了其在神經元細胞周期阻滯和清除PrPSc蛋白中的重要作用和機制，為臨床精準治療朊病毒病提供實驗室研究基礎。
　　本研究主要分兩大部分:
　　第一部分:朊病毒病中PLK1/3信號介導神經元細胞周期阻滯
　　為了觀察朊病毒病中P

6、LK是否參與神經元細胞周期再進入的調控，我們首先采用蛋白免疫印跡、免疫組化、免疫熒光等方法，檢測了朊病毒羊瘙癢因子263K感染的倉鼠腦組織中PLK等細胞周期相關蛋白的組織分布和表達水平的變化，結果發(fā)現(xiàn):與正常腦組織相比，感染263K腦組織的皮質和小腦區(qū)域PLK1和PLK3的染色變化顯著，在感染終末期的腦組織勻漿中PLK1的表達明顯升高，而PLK3的表達明顯降低，甚至消失。動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)在倉鼠朊病毒病的潛伏期PLK1/3的表達即發(fā)生了變化。

7、激光共聚焦分析顯示PLK1/3與皮層灰質區(qū)的神經元標志物Neun存在明顯的共定位，而與膠質細胞的標志物GFAP不發(fā)生共定位，這提示PLK1/3主要分布在神經元中，明確了PLK1/3的表達變化發(fā)生在神經細胞中。進一步檢測發(fā)現(xiàn)PLK1的下游蛋白Cyclin B1的表達也明顯上調，而PLK3的下游蛋白Cdc25C和P-Cdc25C（ser-216）卻表達下調，這些變化可促使神經元再次進入細胞周期，并由G2期向M期轉化，然而M期蛋白P-Hist

8、one H3的表達卻無明顯變化，這一結果說明了朊病毒病中PLK3調控神經元再次進入細胞周期，但并不能完成整個細胞周期，從而引起細胞周期阻滯引發(fā)神經元凋亡，最終導致神經元的丟失。在穩(wěn)定感染朊病毒的SMB-S15細胞系中我們觀察到類似于朊病毒病倉鼠模型中PLK1/3的變化。為了排除細胞系永生化狀態(tài)對研究細胞周期的影響，接著我們又采用PrPSc類似肽106-126處理了小鼠原代皮質神經細胞，結果與上述研究相一致。
　　第二部分:PLK3

9、介導對異常朊蛋白的降解作用
　　為進一步闡明PLK3表達下調與朊病毒病的關系，我們通過GST Pull-down和免疫共沉淀的方法，在體內和體外證實了PLK3和PrP蛋白的相互作用關系，不僅全長的PLK3可以與PrP蛋白發(fā)生相互作用，PLK3蛋白N端的激酶區(qū)(kinasedomain，KD)和C端的Polo盒子區(qū)(Polo-box domain，PBD)都能與PrPSc蛋白發(fā)生相互作用。為了更深入地解析PLK3與PrP蛋白之間發(fā)生

10、相互作用的生物學意義，我們將不同濃度的PLK3蛋白和野生型及突變體PrP蛋白的質粒轉染至HEK293細胞中，結果發(fā)現(xiàn)高濃度的PLK3可以降解突變體PrP蛋白，但對野生型PrP蛋白的表達影響不大。PLK3的這種降解作用似乎依賴于PLK3蛋白的KD區(qū)，而與PBD區(qū)無關。進一步利用RNAi技術敲低PLK3的表達可以明顯增加異常PrP突變體蛋白的水平。利用蛋白酶體和自噬溶酶體抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑和巨自噬抑制劑對PLK3介導的PrP突

11、變體的降解作用無明顯影響，而溶酶體途徑抑制劑能明顯阻斷PLK3對PrP突變體的降解作用，提示該降解作用依賴于溶酶體途徑。我們在穩(wěn)定感染朊病毒的SMB-S15細胞系中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即轉染PLK3質粒后，上調PLK3的表達可以顯著降低異常PrPSc蛋白的水平，而對正常PrPC蛋白的表達水平影響不大。
　　綜上所述，我們的實驗結果表明，終末分化的中樞神經細胞在受到朊病毒病感染因子的刺激下，迅速驅使細胞再次進入細胞周期以應對感染引起

12、的應激壓力，但神經細胞由于缺乏完成有絲分裂的相關調控元件，導致細胞周期被阻滯在M期，致使細胞周期再啟動的失敗，我們推測這種異常的細胞周期再進入事件啟動了凋亡程序，最終導致了神經細胞的死亡。同時我們發(fā)現(xiàn)PLK3蛋白可通過其N端的KD區(qū)介導對朊病毒蛋白的降解。因此，如果在朊病毒感染的早期通過某種干預手段誘導PLK3的表達，有可能防止異常PrPSc蛋白的聚集并阻止細胞周期的再進入，我們的實驗研究結果為朊病毒病的精準靶點治療提供新的線索和思路，