梅毒螺旋體Tp0453重組蛋白的表達、純化及免疫活性研究.pdf

1、目的：構建含梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)外膜蛋白Tp0453的優(yōu)勢表位(28-288aa)基因的重組表達體，在大腸桿菌中進行誘導表達，純化表達產(chǎn)物并進行免疫原性和免疫反應性分析，為探索Tp0453重組蛋白在梅毒血清學診斷中的應用價值和其生物學功能提供實驗依據(jù)?！　》椒ǎ和ㄟ^生物信息學分析，篩選并挑選Tp0453基因優(yōu)勢抗原表位，以TpNichols株基因組DNA為模板，高保真聚合酶鏈反應擴增目的片斷，將其亞克

2、隆進原核表達載體pQE32中、構建重組質(zhì)粒pQE32/Tp0453，然后轉化至表達宿主菌M15中進行誘導表達，利用SDS-PAGE和Western-Blot進行分析和鑒定表達產(chǎn)物；Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，并進行稀釋透析復性，BCA法測定純化蛋白濃度。用純化的Tp0453重組蛋白包被微孔板，建立間接ELISA方法，檢測梅毒參比血清和臨床梅毒患者血清，同時與TPPA法進行比較，根據(jù)重組蛋白與梅毒陰陽性血清的反應情況，評價重組抗原

3、在梅毒血清學診斷中的應用價值。同時用純化的Tp0453重組蛋白免疫新西蘭兔，間接ELISA方法檢測免疫兔血清中Tp0453多克隆抗體的效價，對Tp0453重組蛋白的免疫原性進行分析?！　〗Y果：軟件分析Tp0453基因的抗原表位選擇了Tp0453基因的86～849bp位堿基序列為目的表位(片段長度為764bp，編碼255個氨基酸)；PCR擴增得到以大小約為800bp的目的片斷；構建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定證明其中插入片斷為Tp04

4、53目的基因，測序結果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導下，重組工程菌表達了一相對分子量(Mr)約為32KDa的目的蛋白條帶，目的蛋白在菌體細胞內(nèi)主要以包涵體形式存在；經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得了純度在95％以上的重組蛋白；Western-blot檢測其能與梅毒陽性血清發(fā)生特異性反應；以重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA法，檢測梅毒參考血清，其陰陽性符合率均為100％；對TPPA法檢測的110

5、份陰陽性血清進行檢測，與TPPA法比較ELISA法的靈敏度為96.8％，特異度為100％，ELISA法與TPPA法符合率為98.2％；利用純化的Tp0453重組蛋白免疫新西蘭兔，間接ELISA法測定兔免疫血清特異性抗體效價在1：640以上。 結論：1、成功構建了pQE32/Tp0453原核表達體，將其轉化至大腸桿菌后表達出了一相對分子量(Mr)約32KDa的重組蛋白；2、Tp0453重組蛋白具有較好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產(chǎn)生