嗅鞘細胞移植聯合血管內皮生長因子對大鼠脊髓損傷的保護作用的實驗研究.pdf

1、背景:
　　 脊髓損傷嚴重影響著25萬美國人的生活質量，恢復緩慢，因此成為全世界科學家的研究熱點。已經證實，許多藥物、神經營養(yǎng)因子、組織細胞移植及基因治療是目前主要的脊髓損傷修復措施。其中，終生具有成髓鞘能力的嗅鞘細胞(olfactory ensheathing cells，OECs)深受廣大研究人員的喜愛。脊髓損傷引起的缺血和繼發(fā)性改變使局部條件惡化，加重了神經損傷。因此，改善脊髓損傷局部的血液循環(huán)，減輕繼發(fā)性損傷便成為脊髓損

2、傷的又一研究熱點。已經證實，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在脊髓損傷后表達增加，可能與損傷后的功能恢復有關。
　　 目的:
　　 研究一種簡便、經濟實用的獲得新生大鼠嗅鞘細胞的方法，探討嗅球源性嗅鞘細胞(OECs)移植和鞘內重復注射VEGF對脊髓損傷(SCI)后功能恢復的促進作用，并研究二者對神經元和神經纖維的協(xié)同保護作用。
　　 方法:

3、　　 取1-2天的雌性新生大鼠，無菌條件下取下雙側嗅球，剝去血管和軟腦膜，經胰酶消化和機械吹打分散成單細胞懸液，將差速貼壁后的大鼠嗅鞘細胞首先應用20％胎牛血清和10ug/ml阿糖胞苷培養(yǎng)24小時，然后采用含1％胎牛血清和25ng/ml神經生長因子(nerve growth factor，NGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。每天觀察嗅鞘細胞的生長變化，第9天時采用形態(tài)學和免疫細胞化學染色對細胞及其純度進行鑒定，并收集細胞，調

4、整細胞密度為1x107/ml備用。
　　 將75只實驗動物隨機分為5組，假手術對照組(CON組)、脊髓損傷組(SCI組)、血管內皮生長因子組(VEGF組)、嗅鞘細胞組(OECs組)和聯合治療組（VEGF+OECs組），在脊髓損傷后不同時段進行肢體活動BBB評分，術后8w苯巴比妥麻醉后灌注處死大鼠，取T7-L1脊髓節(jié)段，通過HE染色檢測脊髓損傷區(qū)神經纖維和神經元病理改變；通過免疫組織化學檢測各組大鼠脊髓caspase-3(1：15

5、0)和vWF(1：200)表達。每組3只動物利用透射電鏡觀察超微結構的變化。
　　 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理分析，數據以(-x)±s表示，BBB評分采用重復測量數據的方差分析，判斷行為恢復情況。其他數據的組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　 結果:
　　 體外培養(yǎng)的大鼠嗅鞘細胞神經生長因子受體p75(nerve growth factor receptor p75，NGFRp7

6、5)染色呈陽性反應，細胞呈雙極和三級，突出細長，并漸結成網狀，在體外培養(yǎng)的第7天純度為95％，9天時為90％，且形態(tài)良好。
　　 術前所有大鼠和術后對照組后肢行為評分為21分，術后脊髓損傷動物均出現后肢運動功能的自行恢復，尤其在手術后的前4周。在4周后，VEGF組和OECs組優(yōu)于SCI組，聯合治療組的行為恢復更為明顯。
　　 HE染色和超微結構觀察可見，CON組損傷處殘留少量組織，神經纖維和神經元損害嚴重，大量有髓纖維嚴

7、重受損，中央軸突消失；VEGF組損傷處均見組織增生，神經纖維和神經元受損較CON組輕，OECs組細胞中有大量空泡化的線粒體，OECs+VEGF組神經纖維和神經元損傷最輕，腹側有神經纖維通過，大量薄髓鞘纖維中可見微絲、微管和受損較輕線粒體。
　　 免疫組化顯示，CON組、SCI組、VEGF組、OECs組和VEGF+OECs組Caspase-3陽性細胞數分別為（8.33±5.43）、(25.89±10.75)、(14.62±5.60

8、)、（23.47±8.33）、（13.38±6.33）/HPF，SCI組、VEGF組、OECs組和VEGF+OECs組均顯著高于CON組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05):SCI組、OECs組顯著高于VEGF組、VEGF+OECs組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；
　　 CON組、SCI組、VEGF組、OECs組和VEGF+OECs組脊髓中vWF陽性血管數分別(13.87±2.59)、(11.25±3.19)、(14.42±

9、4.05)、(11.94±3.77)、(16.50±6.25)/HPF。VEGF組、VEGF+OECs組vWF陽性血管數顯著多于SCI組、OECs組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1、阿糖胞苷結合NGF是一種簡單實用的嗅鞘細胞純化培養(yǎng)方法．
　　 2、VEGF對大鼠脊髓損傷修復有一定的促進作用，并可恢復損傷神經的部分功能，對受損神經纖維和神經元有保護作用。
　　 3、嗅鞘細胞移植

10、可部分恢復脊髓損傷大鼠的部分神經功能，對受損神經纖維和神經元有保護作用。
　　 4、嗅鞘細胞(OECs)移植聯合鞘內重復注射VEGF對大鼠脊髓損傷修復有明顯的促進作用，并可恢復損傷神經的部分功能，對受損神經纖維和神經元有保護作用，二者有協(xié)同作用。
　　 意義
　　 本研究采用阿糖胞苷結合NGF體外培養(yǎng)純化大鼠嗅球源性嗅鞘細胞，重力打擊制作脊髓挫傷模型，將嗅鞘細胞移植到脊髓損傷部位，聯合重復鞘內注射VEGF，探討O