化療藥物富集小鼠乳腺癌細胞系4T1中腫瘤干細胞及其耐藥機制研究.pdf

1、目的:利用化療藥物富集小鼠乳腺癌細胞系4T1中腫瘤干細胞(cancerstem cell,CSC),研究腫瘤干細胞的一些耐藥機制,為進一步探索乳腺癌干細胞的調控機制、開發(fā)靶向乳腺癌干細胞的分子制劑奠定基礎。
　　 方法:1化療藥富集乳腺癌干細胞動物模型的建立。收集對數生長期4T1細胞,接種于BALB/c小鼠右肩胛部皮下,建立小鼠乳腺癌模型。將小鼠隨機分為4組,分別為對照組和5-氟尿嘧啶(5-Fu)低、中、高濃度處理組。待小鼠成瘤

2、后,對照組給予生理鹽水,5-Fu處理組分別給予低、中、高濃度(0.05mg/ml、0.1 mg/ml、0.2mg/ml)5-Fu腹腔注射,每天一次,共用七天,七天后改為一周一次,四周后引頸處死小鼠,將腫瘤組織分為三份,一份以中性甲醛固定進行免疫組化檢測,一份用于RNA提取,一份制成細胞懸液用于流式檢測CD44+CD24-/low細胞比例和Hoechest33342染色檢測側群(side population,SP)細胞比例。取CD44+

3、CD24-/low細胞比例最高的5-Fu處理組小鼠腫瘤組織,制備細胞:懸液,建立第二代富集CSC的小鼠移植瘤模型,荷瘤小鼠用相同濃度5-Fu化療,用藥方法同前,如此傳代共制作四代小鼠移植瘤模型。
　　 2采用流式細胞技術(flow cytometry,FCM)檢測各代對照組和5-Fu處理組小鼠移植瘤模型腫瘤組織中CD44+CD24-/low細胞的比例。
　　 3采用Hoechst33342染色法檢測各代對照組和5-Fu處

4、理組小鼠移植瘤模型腫瘤組織中SP細胞比例。
　　 4免疫組化法檢測各代對照組和5-Fu處理組小鼠移植瘤模型腫瘤組織中CD55和ALDH1蛋白的表達。
　　 5觀察無血清培養(yǎng)各代對照組和5-Fu處理組小鼠移植瘤組織細胞微球體的形成,計數微球體的數目并計算微球體的形成效率。
　　 6觀察第三代5-Fu處理組小鼠移植瘤細胞形成的微球體在有血清培養(yǎng)環(huán)境下的誘導分化。
　　 7動物致瘤實驗檢測第三代對照組和5-Fu

5、處理組小鼠移植瘤細胞的致瘤能力。
　　 8經HE染色,光鏡下觀察小鼠移植瘤模型腫瘤組織形態(tài)學變化。
　　 9采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR,RT-PCR)半定量和實時定量PCR(Real-time PCR)技術檢測第三代對照組和5-Fu處理組小鼠移植瘤組織中MDR1、BCRP、ALDH1和β-catenin mRNA的表達。
　　 結果:1利用化療藥5-Fu誘導下4T

6、1細胞系在小鼠體內傳代的方法,建立了富集乳腺癌干細胞的小鼠移植瘤模型,將從5-Fu處理組第一、二、三、四代小鼠模型腫瘤組織中分離所得細胞分別命名為4T1-lst、4T1-2nd、4T1-3rd、4T1-4th細胞,而對照組小鼠腫瘤組織分離所得細胞命名為parental4T1細胞。
　　 2 FCM檢測結果顯示,第一代對照組小鼠移植瘤組織中CD44+CD24-low細胞比例為11.5±0.9％,低、中、高濃度5-Fu處理后其比例分

7、別為40.1±3.4％、49.8±1.2％、45.64±1.6％,明顯高于對照組(P<0.05)。中、高濃度組明顯高于低濃度組(P<0.05),而中、高濃度組之間無明顯差異(P>0.05)。中濃度5-Fu處理后小鼠移植瘤組織中CD44+CD24-low細胞比例高于其它兩組,所以選擇中濃度(0.1mg/ml)5-Fu進行后續(xù)的實驗。5-Fu處理組第一、二、三、四代小鼠移植瘤組織中CD44+CD24-/low細胞比例分別為49.8±1.26

8、％、56.8±1.76％、66.4±1.5％、69.0±1.6％,顯著高于對照組(P<0.01)。隨著傳代次數的增加,CD44+CD24-/low細胞比例逐漸升高,除第三、四代之間差異不明顯(P>0.05)外,其他各代之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3 Hoechst33342染色結果顯示,5-Fu處理組第一、二、三、四代小鼠移植瘤組織中SP細胞比例分別為25.0±1.21％、42.6±2.8％、58.4±2.2

9、％、61.3±2.6％,顯著高于對照組的9.7±1.4％(P<0.01)。隨著傳代次數的增加,SP細胞比例逐漸升高,除第三、四代之間差異不明顯(P>0.05)外,其他各代之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4免疫組化結果顯示,對照組小鼠移植瘤組織中ALDH1表達為陰性,5-Fu處理組第一、二、三、四代小鼠移植瘤組織ALDH1表達為弱陽性到陽性,隨著傳代次數的增加5-Fu處理組ALDH1表達水平逐漸升高。5-Fu處理組

10、第一、二、三、四代小鼠移植瘤組織中CD55強表達細胞數分別為7.8±1.6％、10.1±2.0％、15.6±1.4％、17.3±1.9％,明顯高于對照組的0.6±0.3％(P<0.01),且隨著傳代次數的增加5-Fu處理組CD55表達水平逐漸升高。
　　 5無血清培養(yǎng)小鼠移植瘤細胞結果顯示,4T1-3rd細胞微球體形成效率為5.9±0.4％,parental4T1細胞微球體形成效率為0.5±0.2％,前者約是后者的12倍(P<0

11、.01)；4T1-3rd細胞形成的第一代微球體可以傳代形成相同比例的第二、三代微球體且可傳至5代,而parental4T1細胞形成的微球體只傳至3代后就不再形成細胞球,開始黏附、分化。4T1-4th細胞微球體形成效率為6.1±0.3％,與4T1-3rd.細胞之間無明顯差異(P>0.05)。
　　 6有血清培養(yǎng)微球體的誘導分化結果顯示,4T1-3rd微球體細胞可在有血清培養(yǎng)基中逐漸貼壁分化,并且可以連續(xù)傳代。
　　 7動物

12、致瘤實驗結果顯示,4T1-3rd細胞的致瘤能力明顯高于parental4T1細胞。
　　 8經HE染色光鏡下觀察結果顯示,所有荷瘤小鼠的移植瘤組織均為乳腺癌組織,接種4T1-3rd細胞和。parental4T1細胞的小鼠腫瘤組織在形態(tài)學上無明顯差異。
　　 9半定量RT-PCR檢測結果顯示,第三代5-Fu處理組小鼠移植瘤組織中MDR1、BCRP、ALDH1mRNA表達水平升高,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01

13、),而β-catenin mRNA的表達水平在兩組之間未見明顯差異(P>0.05)。
　　 Rt-PCR檢測結果顯示,5-Fu處理組小鼠移植瘤組織中MDR1、BCRP和ALDH1mRNA的表達較對照組分別上調了4.35、6.14、3.78倍,二者相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；β-catenin mRNA的表達上調了1.75倍,二者相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論:1利用化療藥5-Fu富集的乳

14、腺癌干細胞建立了荷瘤小鼠動物模型,經在小鼠體內傳代產生了高度惡性的小鼠乳腺癌細胞4T1-3rd,4T1-3rd細胞中富集了高純度的CSC,提示應用化療藥是篩選乳腺癌干細胞的有效方法。
　　 2第三代5-Fu處理組小鼠移植瘤組織高表達MDR1和BCRP,說明乳腺癌干細胞可能通過MDR1和BCRP表達上調產生對化療藥物的抵抗性,逃逸化療藥物的攻擊。
　　 3第三代5-Fu處理組小鼠移植瘤組織中β-catenin表達水平升高,