人SCL基因重組腺病毒表達載體的構建.pdf

1、目的： 構建含人SCL基因的pDC315-SCL重組腺病毒載體, 為下一步研究SCL基因在ICC樣細胞的功能奠定基礎。
　　 方法： 從含有人SCL基因的質(zhì)粒中，采用PCR方法擴增SCL基因，將目的載體pDC315-EGFP進行酶切后交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞，對克隆產(chǎn)物進行菌落PCR鑒定，對陽性克隆產(chǎn)物進行測序和比對分析，比對正確的克隆即為構建成功的重組穿梭質(zhì)粒。pDC315-EGFP/SCL,在脂質(zhì)體介導下與腺病毒輔助大

2、質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染293細胞，包裝產(chǎn)生復制缺陷型重組腺病毒pDC315-SCL經(jīng)HEK293細胞擴增，純化后測定病毒滴度。通過觀察綠色熒光蛋白的表達評估重組腺病毒對Cajal樣間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)染率。
　　 結果： PCR擴增的SCL基因片段長度為1036bp，測序結果以及重組質(zhì)粒pDC315-EGFP-SCL陽性克隆凝膠電泳鑒定均證明SCL基因成功克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒真核表達載體中。pDC315-S

3、CL重組腺病毒載體通過PCR結果證明和Western Blot檢測證實pDC315-SCL重組腺病毒載體構建成功，滴度達到1×1010PFU/mL，對膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)染率可達95%。
　　 結論： 成功構建了含人SCL基因真核表達載體pDC315-EGFP-SCL和應用AdMax載體系統(tǒng)成功構建含人SCL基因重組腺病毒載體pDC315-SCL。pDC315-SCL重組腺病毒載體對Cajal樣間質(zhì)細胞有很高的轉(zhuǎn)染效率。