Tim3參與巨噬細胞炎癥反應的機制及對巨噬細胞抗原呈遞作用的研究.pdf

1、背景：T 細胞免疫球蛋白及粘蛋白家族-3（Tim3）作為Tim 家族的成員，有281個氨基酸組成，最先被發(fā)現特異的表達在CD4+Th1 細胞上，而不在Th2 細胞上表達。這個發(fā)現促使人們去研究Tim3是如何調節(jié)Th1 型細胞反應，又是如何在自身免疫性疾病中發(fā)揮作用？ Tim-3分子通過負性調節(jié)Th1 細胞的功能廣泛參與了特異性免疫應答的調節(jié)。近期研究發(fā)現，Tim-3 在DC、單核細胞、巨噬細胞等天然免疫細胞表面也有表達，通過激活炎癥細胞

2、發(fā)揮促炎癥作用。
　　 目的：探討Tim-3 對巨噬細胞功能的調節(jié)作用及其機制。
　　 方法：（1）首先將含Tim-3SiRNA及NC 對照序列的載體經脂質體分別轉染細胞系RAW264.7，以G418 加壓篩選，通過RNA 干擾降低Tim3 在巨噬細胞表面的表達，構建了一種穩(wěn)定低表達Tim3的RAW264.7 巨噬細胞系。以野生型及低表達Tim3的巨噬細胞為研究對象，探討Tim-3 對巨噬細胞活性及表型的影響。（2）體外

3、阻斷或激活Tim3通路，ELISA法檢測巨噬細胞等天然免疫細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6的水平；通過Western blot 方法檢測炎癥反應信號通路中關鍵分子AKT、PAKT、NF-kB的變化；通過ELISA法、Western blot 檢測Tim-3 與模式識別受體TLR4的相互作用。雙熒光素酶報告基因系統檢測NF-kB的活性。通過以上方法檢測Tim3 參與巨噬細胞炎癥反應的機制。(3)建立敗血癥動物模型，觀察Tim3 在敗血

4、癥早期和晚期的不同作用。(4)以敗血癥小鼠模型為基礎，Tim-3 體內阻斷實驗檢測Th1、Th17 細胞活性，研究Tim-3 對Th1,Th17的分化的影響以及對小鼠腹腔巨噬細胞表面共刺激分子CD80、CD86的表達的影響。同時體外實驗檢測Tim3 對巨噬細胞表面共刺激分子CD86/CD80表達比例的影響以及對Th1,Th17的分化的影響。從體內實驗和體外實驗兩方面探討Tim3 對巨噬細胞抗原呈遞作用及對Th1,Th17 細胞極化的影響

5、。
　　 結果：（1）成功構建了重組載體Tim3-siRNA，建立了穩(wěn)定低表達Tim3的巨噬細胞系。(2)為了探討Tim-3 在天然免疫中的調節(jié)作用，我們觀察了Tim-3 對巨噬細胞活性的影響，結果顯示Tim-3 刺激巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6。同時ELISA 結果顯示Tim3 通路和TLR4 通路在刺激巨噬細胞釋放炎性因子TNF-α方面存在相互拮抗效應。
　　 Western blot 結果也顯示Tim3

6、 信號通路和TLR4 信號通路的相互拮抗關系涉及到對一些重要的信號分子的影響，如AKT活性過強抑制了NF-kB活性，從而抑制了LPS 介導的TNF-α的分泌。（3）體內實驗結果顯示，以敗血癥小鼠模型為基礎，Tim-3 在敗血癥早期表達升高，發(fā)揮抗炎作用，而在敗血癥后期表達失調。（4）體內體外實驗結果顯示，Tim-3 在提高CD86，降低CD80，提高CD86/CD80的比例中發(fā)揮重要作用。同時Tim-3可以促進Th1及Th17 細胞的分

7、化，表現為Th1 型細胞因子IFN-γ，以及Th17 型細胞因子IL-17表達的升高。
　　 小結：（1）Tim3 通過促使巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6 參與了天然免疫反應調節(jié)。（2）Tim3 通路和TLR4 信號通路在介導炎癥反應方面存在相互拮抗效應。（3）Tim3參與了巨噬細胞表面CD80，CD86 共刺激分子的調節(jié)，Tim-3 通過提高CD86/CD80的比例促進Th1及Th17 細胞的分化。（4）本實驗為認識