人hIL-24Δ103重組腺病毒載體的構(gòu)建及對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶入hIL-24△103基因的重組腺病毒載體，并檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響，為進(jìn)一步研究白介素24細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路奠定了基礎(chǔ)。 方法：本課題采用PCR技術(shù)以重組質(zhì)粒Pgex-IL-24為模板擴(kuò)增人白介素24 N端104-206位氨基酸殘基編碼序列，PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體，藍(lán)白斑初步篩選，挑取白色菌落，經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切及測(cè)序鑒定正確后酶切并膠回收目的片段，亞克隆至穿梭載體pAdTrack-C

2、MV中。鑒定正確的穿梭載體經(jīng)PmeⅠ酶切后與腺病毒骨架載體pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化BJ5183菌挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)PacⅠ酶切鑒定正確。腺病毒載體經(jīng)PacⅠ酶切后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝并大量擴(kuò)增Ad-hIL-24△103腺病毒，重組病毒感染A549細(xì)胞，MTT觀察細(xì)胞活力，Hoechst33258染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。Western blotting檢測(cè)PKR、eIF-2α蛋白表達(dá)及活化。 結(jié)果：通過(guò)PCR獲得目的基因h

3、IL-24△103，2％瓊脂糖凝膠電泳顯示目的片段大小約312bp。目的基因克隆入pMD18-T載體后，挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)雙酶切，PCR可見(jiàn)目的條帶，測(cè)序正確。目的基因亞克隆至pAdTrack-CMV后雙酶切及PCR鑒定正確。同源重組后腺病毒載體經(jīng)PacⅠ酶切得到一條23kb左右的大片段和一條約4.5 kb的特征性小片段，表明重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。線性化的重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞3d后熒光顯微鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞有EGFP表達(dá)，細(xì)

4、胞出現(xiàn)病變效應(yīng)，細(xì)胞核大，黏附力降低。取病毒上清作PCR鑒定可見(jiàn)hIL-24△103目的條帶。Western blotting可檢測(cè)到15kd處有一蛋白條帶，為hIL-24△103蛋白，表明重組腺病毒包裝成功。TCID法測(cè)病毒滴度為2×1010 PFU/mL。 hIL-24△103重組腺病毒感染A549細(xì)胞后MTT檢測(cè)細(xì)胞活力隨病毒量增加而顯著降低，相對(duì)細(xì)胞活力在10 PFU/mL時(shí)為0.95，25PFU/mL時(shí)為0.71，5

5、0 PFU/mL時(shí)為0.47，100 PFU/mL時(shí)為0.20。Hoechst33258染色顯示hIL-24△103重組腺病毒感染的A549細(xì)胞核深染、固縮、碎裂，出現(xiàn)典型的凋亡小體。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示hIL-24△103重組腺病毒處理組凋亡率為22.42±0.69，相比空病毒處理（1.25±0.53）組和PBS對(duì)照（1.03±0.37）組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blotting檢測(cè)到hIL-24△103重組腺病毒處理組P