白藜蘆醇抵御奶牛乳腺上皮細胞氧化應激的作用機制研究.pdf

1、乳腺上皮細胞是乳汁合成的主要場所，與乳產量和乳品質密切相關。乳腺上皮細胞在生理及病理階段，易發(fā)生氧化應激。抵御乳腺上皮細胞的氧化應激和增強其抗氧化能力是維持乳腺健康和高效泌乳的有效手段。白藜蘆醇是一種高效的抗氧化劑，大量研究發(fā)現(xiàn)了它的保健和治療功效，然尚無研究將其用于健康的乳腺抗氧化研究。本研究首先采用H2O2刺激MAC-T細胞構建了奶牛乳腺上皮細胞氧化應激模型，評價了白藜蘆醇抵御乳腺上皮細胞氧化應激的效果。然后利用分子生物學手段探索了

2、白藜蘆醇通過Nrf2-ARE信號通路、MAPK及PI3K/AKT等信號通路對乳腺上皮細胞抵御氧化應激的保護作用機理。最后通過向哺乳期ICR小鼠日糧中添加低劑量及高劑量的白藜蘆醇檢測白藜蘆醇在哺乳期飼喂的安全性，并明確其對乳腺的氧化還原平衡及對Nrf2-ARE信號通路的調控作用。主要研究結果如下:
　　1.白藜蘆醇保護奶牛乳腺上皮細胞抵御H2O2誘導的氧化損傷
　　1.1構建H2O2誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激模型。采用了不

3、同濃度不同時間的H2O2刺激MAC-T檢測細胞增殖、細胞死亡率、ROS蓄積情況、細胞的氧化平衡情況、細胞內線粒體損傷（BAX和BCL2）和內質網損傷指標（GPR78和CHOP）基因的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)500μMH2O2處理MAC-T細胞24 h可以引起顯著地細胞活力損失，導致細胞凋亡發(fā)生，處理MAC-T細胞12 h引起顯著地ROS過量產生，并伴隨著總抗氧能力和超氧化物歧化酶活性的下降，500μMH2O2處理導致GPR78和CHOP基因表

4、達在4h達到最大，BAX/BCL2最大值則在24h出現(xiàn)。由此確定500μM以上H2O2處理MAC-T細胞引起細胞氧化損傷，主要表現(xiàn)為細胞活力損傷、細胞死亡加劇、氧化還原平衡被破壞，并伴隨著線粒體及內質網損傷，并在后續(xù)研究中采用500μM H2O2處理MAC-T細胞構建氧化應激損傷模型。
　　1.2明確白藜蘆醇對H2O2誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷的保護效果。采用不同濃度白藜蘆醇處理MAC-T細胞確定MAC-T24 h內能夠耐受的

5、白藜蘆醇的最高濃度是50μM。接著基于前期構建的氧化應激模型，采用50μM以下不同濃度的白藜蘆醇或溶劑對照預處理2h而后加入H2O2或PBS的處理特定時間來檢測細胞增殖、細胞死亡率、ROS蓄積情況、細胞的氧化平衡情況、細胞內線粒體損傷（BAX和BCL2）和內質網損傷指標（GPR78和CHOP）基因的表達變化。結果發(fā)現(xiàn)，較之H2O2處理，白藜蘆醇預處理后再加入H2O2的細胞活力損失、細胞凋亡率、細胞內的ROS蓄積程度隨白藜蘆醇的濃度的增加

6、而下降。而且白藜蘆醇的添加增加了細胞的總抗氧化能力。50μM白藜蘆醇削弱了H2O2誘導的線粒體損傷和內質網損傷。結果顯示白藜蘆醇可以保護乳腺上皮細胞抵御H2O2誘導的氧化損傷
　　2.白藜蘆醇保護乳腺上皮細胞抵御H202誘導的氧化損傷的作用機制
　　2.1檢測白藜蘆醇及H2O2處理對奶牛乳腺上皮細胞中Nrf2-ARE-抗氧化酶鏈的作用。首先檢測白藜蘆醇和H2O2單獨/組合處理MAC-T后細胞內的抗氧化關鍵基因TXNRD1、H

7、O-1、XCT、NQO-1的表達豐度變化，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇預處理后無論是否有H2O2刺激，細胞內的抗氧化關鍵基因表達在特定的時間內均被激活表達，且較之H2O2單獨處理組，白藜蘆醇+ H2O2處理的抗氧化基因均在8h顯著增強。采用不同濃度白藜蘆醇處理細胞后加入H2O2刺激發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對于抗氧化基因的表達具有劑量依賴性，有報道證實這些基因是Nrf2-ARE信號通路的靶基因。接著我們檢測發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇促進了H2O2處理下Nrf2蛋白的核轉移程度，并

8、促進了細胞內的ARE原件的激活。由此證實白藜蘆醇激活了細胞內的Nrf2-ARE-抗氧化鏈。
　　2.2明確白藜蘆醇依賴Nrf2發(fā)揮奶牛乳腺細胞保護作用。通過siRNA沉默Nrf2基因表達后重新評估白藜蘆醇的保護效果，研究發(fā)現(xiàn)細胞內的Nrf2-ARE-抗氧化鏈的關鍵靶基因表達在H2O2和白藜蘆醇+H2O2處理中均被抑制。而且siRNA沉默Nrf2基因表達后白藜蘆醇預處理不能保護細胞免受H2O2誘導的細胞活力損失，甚至siRNA沉默N

9、rf2基因表達后H2O2處理導致的內質網應激加劇。由此得出白藜蘆醇是通過Nrf2-ARE信號通路實現(xiàn)保護乳腺上皮細胞的作用的。
　　2.3探索白藜蘆醇通過MAPK、PI3K/AKT信號通路對Nrf2-ARE信號通路激活的作用。檢測白藜蘆醇及H2O2單獨/組合處理MAC-T后細胞內AKT、ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化水平的時間劑量作用，結果發(fā)現(xiàn)H2O2單獨處理激活了所有上述信號轉導關鍵蛋白的活化，而白藜蘆醇預處理則延長

10、了AKT及ERK1/2的磷酸化時間。后期采用抑制劑預處理抑制細胞內PI3K/AKT、ERK1/2、JNK1/2、p38信號通路的激活，再采用白藜蘆醇及H2O2單獨/組合處理發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能是通過EKR、PI3K/AKT信號通路激活Nrf2-ARE信號通路實現(xiàn)保護乳腺上皮細胞的作用，而p38信號通路則抑制了白藜蘆醇對Nrf2-ARE信號通路的激活作用及細胞保護作用的發(fā)揮。
　　3.日糧添加白藜蘆醇對哺乳期小鼠乳腺氧化損傷及生產性能的

11、影響
　　該部分采用單因素多水平試驗探索了日糧中添加白藜蘆醇對哺乳期ICR小鼠乳腺的抗氧化作用，白藜蘆醇的添加劑量為0、0.02％、0.2％。通過母鼠采食量、體重、器官分數(shù)、乳腺重量變化發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的添加不會對母鼠這些指標造成負面影響，通過間接法評估乳產量也未發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有促進乳產量的作用。對仔鼠的窩重，日增重及器官發(fā)育分數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇不會對仔鼠以上發(fā)育指標產生負面作用，提示哺乳期食入一定劑量白藜蘆醇是安全的。
　　通

12、過采集母鼠的乳腺、肝臟、腎臟等器官檢測器官總抗氧化能力、脂質過氧化物、超氧化物歧化酶酶活力，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的添加顯著降低了泌乳期ICR小鼠乳腺中的脂質過氧化程度，減少氧化損傷，而對肝臟和腎臟則無上述效果。同時對乳腺的抗氧化基因mRNA表達的檢測發(fā)現(xiàn)，0.2％白藜蘆醇添加的小鼠乳腺中SOD2、GPX1、PRX1、TXNRD1的基因表達顯著上調，而0.02％以上的白藜蘆醇添加小鼠乳腺中TXNRD1、HO1、Nrf2蛋白表達均顯著上調，提示日糧

13、添加白藜蘆醇可以減少哺乳期小鼠乳腺氧化損傷，促進Nrf2-ARE-抗氧化鏈信號通路。
　　綜上所述，本研究成功構建了奶牛乳腺上皮細胞氧化應激模型，利用此模型研究了白藜蘆醇在乳腺上皮細胞中的抗氧化損傷作用及其機制，并采用在體實驗證實了白藜蘆醇的乳腺保護作用及其對Nrf2-ARE-抗氧化鏈的調節(jié)作用。其中Nrf2-ARE-抗氧化鏈在乳腺抗氧化應激和細胞存活中發(fā)揮重要作用，白藜蘆醇可能通過PI3K/AKT、ERK通路影響Nrf2-ARE