弓形蟲P30單基因疫苗與P30-ROP2復合基因疫苗免疫小鼠的實驗研究.pdf

1、隨著分子生物學技術在寄生蟲學研究領域的應用和發(fā)展，弓形蟲疫苗從最早的全蟲疫苗到新近迅速發(fā)展起來的核酸疫苗均取得了很大進展。但是，弓形蟲滅活疫苗免疫保護力低；減毒活疫苗易恢復毒力，不能用于人體；亞單位疫苗生產過程復雜，且抗原蛋白不能形成正確的天然構象因此免疫活性不足，使得弓形蟲核酸疫苗成為一個新的研究方向。同時，越來越多的證據表明，弓形蟲階段特異性抗原分子只能激發(fā)機體的階段特異性保護免疫[2,3]。因此，使用來自不同階段的多抗原基因的復合

2、基因疫苗可能刺激機體產生較全面的免疫保護性。 P30(SAG1)作為弓形蟲速殖子期特異的主要表面抗原之一，具有高度的免疫原性和免疫保護性，是弓形蟲感染免疫診斷和疫苗開發(fā)的的主要候選抗原。ROP2(Rhoptry2)蛋白是弓形蟲棒狀體分泌的一種蛋白，主要協(xié)助蟲體入侵宿主細胞，在弓形蟲生活史的速殖子期、緩殖子期和子孢子期中均有表達，具有高度的保守性和免疫原性，能充分刺激機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)保護性免疫反應，其作為疫苗候選分子具有巨大的

3、潛力。 本研究應用基因工程方法構建弓形蟲單基因真核表達質粒pcDNA3.1-P30；并將之與pcDNA3.1-P30-ROP2復合基因真核表達質粒分別瞬時轉染人宮頸癌細胞系(Hela)細胞，轉染48小時后用Trizol提取細胞總RNA，以Oligo(dT)18為引物逆轉錄生成cDNA第一條鏈；對管家基因β-actin進行PCR驗證逆轉錄；然后分別對P30、P30-ROP2基因片段進行PCR，證實真核表達載體pcDNA3.1能夠攜

4、帶弓形蟲抗原基因P30及P30-ROP2在哺乳動物細胞中轉錄表達。此后，用堿裂解法大量制備質粒pcDNA3.1-P30及pcDNA3.1-P30-ROP2，以肌注方式接種BalB/c小鼠(100μg/只)，分別于2周、4周后加強免疫一次，并設立PBS組、pcDNA3.1空載體組為對照，觀察分析核酸疫苗所誘導的小鼠的免疫效應以及抵抗致死劑量弓形蟲感染的能力。分別于第14天(二次免疫前)、第28天(三次免疫前)、第42天(三次免疫后兩周)、

5、第56天(三次免疫后四周)用眼眶后靜脈叢采血法收集小鼠血清。并于第56天，每組處死8只動物，制備脾細胞懸液用于后續(xù)細胞實驗；每組其余動物用做攻擊感染實驗。ELISA法測定小鼠血清IgG抗體；MTT法測定小鼠脾臟NK細胞殺傷活性以及淋巴細胞轉化率；用羊抗鼠細胞因子試劑盒測定小鼠血清IFN-γ、IL-4；流式細胞技術測定淋巴細胞亞群；弓形蟲RH株攻擊感染。結果：兩實驗組(pcDNA3.1-P30組及pcDNA3.1-P30-ROP2組)小鼠

6、抗體滴度均于三次免疫后四周達到最高值，且與對照組間差別具有顯著性意義(P＜0.01)；pcDNA3.1-P30及pcDNA3.1-P30-ROP2組的NK細胞殺傷率分別為41.34±0.89、41.36±0.95，pcDNA3.1及空白對照組分別為40.32±1.16、40.36±2.09。兩實驗組與對照組間差別均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；兩實驗組淋巴紐胞轉化率較對照組均有提高，其中僅復合基因組與對照組間差別具有顯著性意義(P＜0.