人臍靜脈內皮細胞移植治療角膜內皮衰竭的實驗研究.pdf

1、目的：角膜內皮疾病如大泡性角膜病變、Fuchs角膜內皮營養(yǎng)不良、內眼手術后內皮失代償等是導致角膜混濁和視力下降的重要原因。每年全世界約有100萬以上的患者因為角膜內皮功能失代償而導致失明，目前唯一有效的治療方法是穿透性角膜移植術。雖然該術式成功率較高，但由于供體角膜缺乏、術后排斥反應、角膜供體老齡化等原因而受到限制。組織工程化角膜是當今眼科領域的研究熱點，而亟待解決關鍵問題之一是如何構建角膜內皮組織。人們嘗試多種方法培養(yǎng)角膜內皮細胞，但

2、因受到供體角膜缺乏，載體穩(wěn)定性差，手術操作中易破碎等因素限制，至今仍無法應用于臨床。為尋求一種不依賴于供體角膜而構建角膜內皮組織的有效方法，本實驗首次取人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical veinendothelial cell，HUVEC)進行體外培養(yǎng)擴增，代替有限的角膜內皮細胞，并以異種脫細胞角膜基質為載體進行后板層角膜移植(Posterior lamellarendothelial keratoplasty，PLEK

3、)治療機械性損傷所致的兔角膜內皮衰竭，通過與單純脫細胞角膜基質移植及單純去除內皮進行對比，探討異種脫細胞角膜基質培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞移植治療角膜內皮衰竭的可行性。 方法：1．動物模型：30只新西蘭白兔(2.5～3kg)，麻醉后沿左眼角膜緣切開270°，顯微鏡下全角膜范圍去除角膜內皮細胞，建立機械損傷所致的內皮衰竭動物模型。將動物模型隨機分為3組，實驗組、基質組和對照組，每組10只動物，4周后實驗組和基質組行后板層角膜移植術。2．

4、載體制備：取豬角膜全層，制成直徑為7.5 mm、厚約0.1mm板層角膜片，以Triton-胰蛋白酶聯(lián)合方法進行脫細胞處理，對脫細胞基質進行HE染色，觀察細胞是否去除完全。3．細胞培養(yǎng)：采用0.1﹪膠原酶Ⅰ灌流消化法獲取人臍靜脈內皮細胞，用含有20﹪胎牛血清和10ng/ml VEGF的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)5～7天，當細胞達到80﹪～90﹪融合生長時進行消化傳代。將第二代細胞以2×10<'6>個/cm<'2>密度接種

5、于制備好的脫細胞角膜基質上繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察，一周時細胞在脫細胞角膜基質上生長成完整單層后用于移植。4．移植手術：做直徑為9 mm、3/4角膜厚度的帶蒂前層角膜瓣并掀置一側，再用直徑7.25 mm的環(huán)鉆鉆去中央后部1/4層角膜，形成植床，將植片置于植床，8-0可吸收線間斷縫合，10-0尼龍線：間斷縫合前層角膜瓣，術后觀察3個月。結果：培養(yǎng)皿中及脫細胞角膜基質上培養(yǎng)的細胞均在24小時完成貼壁，開始為短梭形或多角形，一周時形

6、成單層，細胞呈“鋪路石樣”外觀，大小一致，排列緊密。脫細胞角膜基質為半透明薄片，組織學觀察細胞結構完全消失，纖維支架保存良好，排列疏松。術后3個月時，實驗組兔角膜水腫程度較基質組和對照組明顯減輕，透明度增加，內皮細胞密度為(2026.4±129.3)個/mm<'2>，中央角膜厚度平均為(505.2±25.4)μm，基質組中央角膜厚度平均為(1535.6±114.5)μm，而對照組為(1493.5±70.2)μm。 結論：本實驗成