GlyRS通過ELP4調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成的機理.pdf

1、乳蛋白的合成及調(diào)控是哺乳動物乳腺上皮細胞內(nèi)非常重要的代謝過程。乳蛋白合成的機理是重要的生命科學基礎(chǔ)問題之一，近年來的研究已有一些明顯的進展。已發(fā)現(xiàn)催乳素通過JAK2/STAT5信號通路在轉(zhuǎn)錄水平控制乳蛋白生成過程，氨基酸通過mTOR/S6K1信號通路在翻譯水平調(diào)控乳蛋白合成過程。但乳腺細胞內(nèi)乳合成的詳細生化機制尚不清楚。本實驗室前期實驗發(fā)現(xiàn)甘氨酰tRNA合成酶可以在細胞核內(nèi)參與調(diào)節(jié)乳蛋白合成，然而具體調(diào)節(jié)作用方式還不知道，闡明此機制將有

2、助于揭示乳蛋白合成的詳細分子作用機制。本實驗研究了蛋氨酸刺激下，甘氨酰tRNA合成酶通過ELP4對乳蛋白合成的影響，以闡明甘氨酰tRNA合成酶下游信號分子ELP4的作用機制。本研究為甘氨酰tRNA合成酶和ELP4對乳蛋白基因表達的調(diào)節(jié)及其作用機理提供基本理論依據(jù)，并為乳蛋白合成的網(wǎng)絡(luò)信號通路提供了一個新的視野。
　　本研究選用組織塊培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)并得到了純化的奶牛乳腺上皮細胞，用蛋白質(zhì)免疫印記(WB)和免疫熒光(IF)檢測細胞中

3、角蛋白18(CK18)和CSN2的表達以鑒定細胞的純度和泌乳功能。實驗通過在培養(yǎng)液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸，建立了細胞的泌乳模型，用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和WB方法，檢測添加蛋氨酸泌乳模型中，ELP4的表達情況。結(jié)果表明，在蛋氨酸促進細胞泌乳時，ELP4的表達顯著上升(p＜0.01)。對ELP4進行過表達并利用WB檢測CSN2的表達，結(jié)果顯示，ELP4過表達后CSN2表達顯著上升(p＜0.01)。這說明，在蛋氨酸上

4、調(diào)CSN2表達的過程中，ELP4可能是一個重要的調(diào)節(jié)因子。本實驗用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)沉淀并鑒定了細胞中ELP4的相互作用蛋白GlyRS。構(gòu)建真核表達載體ELP4-EGFP和GlyRS-RFP，應(yīng)用激光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)、定量免疫共沉淀和激光共聚焦共定位等技術(shù)，檢測添加蛋氨酸對GlyRS與ELP4相互作用的影響。結(jié)果顯示，添加蛋氨酸泌乳模型中，GlyRS與ELP4的結(jié)合顯著增加(p＜0.01)。對GlyRS進行過表達和干擾

5、，WB檢測ELP4和CSN2的表達的變化。結(jié)果顯示，GlyRS過表達后，ELP4的表達顯著增加(p＜0.01)，CSN2的表達顯著增加(p＜0.01); GlyRS干擾后，ELP4的表達顯著下降(p＜0.01)，CSN2的表達顯著下降(p＜0.01)。這說明，ELP4與GlyRS結(jié)合應(yīng)答蛋氨酸直接參與CSN2合成的調(diào)節(jié)。接著研究了GlyRS過表達和干擾后對p-NFκB1與ELP4的啟動子序列結(jié)合情況的影響，結(jié)果表明，GlyRS過表達后，