荷葉鐵線蕨PIN基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、生長(zhǎng)素在植物許多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要角色，如頂端優(yōu)勢(shì)、花序和葉序的發(fā)育、胚的發(fā)育等，這些過(guò)程都依賴(lài)生長(zhǎng)素濃度梯度的建立。PIN基因編碼生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體蛋白，能夠在植物的花器官形成中發(fā)揮重要作用。本研究以無(wú)配子生殖和有性生殖的荷葉鐵線蕨為原材料，分離出與生殖器官發(fā)育有關(guān)的PIN基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行表達(dá)分析，以期從分子水平上揭示與蕨類(lèi)植物無(wú)配子生殖相關(guān)的基因，為通過(guò)基因工程對(duì)研究荷葉鐵線蕨的發(fā)育調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。主要研究成果:
　

2、　1.荷葉鐵線蕨PIN基因的克隆及生物信息學(xué)分析。利用荷葉鐵線蕨轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中的基因片段信息，篩選無(wú)配子生殖庫(kù)中注釋基因差異表達(dá)較為明顯的PIN基因，根據(jù)PIN基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，利用TAIL-PCR技術(shù)最終從荷葉鐵線蕨中分離到兩個(gè)PIN基因，命名為ArsPIN1和ArsPIN2。ArsPN1基因全長(zhǎng)cDNA為2440 bp，ORF區(qū)長(zhǎng)2052 bp，編碼683個(gè)氨基酸;ArsPIN2基因全長(zhǎng)cDNA為2033 bp，ORF區(qū)長(zhǎng)1923

3、 bp，編碼640個(gè)氨基酸。對(duì)荷葉鐵線蕨兩個(gè)PIN基因的蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，它們都是不穩(wěn)定的疏水蛋白，且蛋白的亞細(xì)胞主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因與多種植物的PIN基因具有高度同源性，兩端都各有一個(gè)完整的膜蛋白結(jié)構(gòu)功能域，且均為疏水區(qū)段，中間區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)段。每個(gè)疏水區(qū)段均有幾次跨膜折疊，此結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其所行使的跨膜運(yùn)輸功能一致。
　　2.荷葉鐵線蕨PIN基因的時(shí)空表達(dá)檢測(cè)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)分析PIN基因在

4、荷葉鐵線蕨配子體和孢子體中的表達(dá)情況，結(jié)果表明:在有性生殖中，有性器官分化的配子體時(shí)期PIN基因的表達(dá)量最高，說(shuō)明PIN基因在荷葉鐵線蕨的性器官發(fā)育中起著重要的作用;在無(wú)配子生殖中，PIN基因在孢子體中的表達(dá)量都顯著低于配子體中的表達(dá)量，推測(cè)荷葉鐵線蕨的無(wú)配子生殖可能與PIN基因從配子體到孢子體的表達(dá)下調(diào)有某種關(guān)系。
　　3.荷葉鐵線蕨PIN基因的遺傳轉(zhuǎn)化分析。成功構(gòu)建荷葉鐵線蕨PIN基因的過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA2300-Ar