奶牛乳腺發(fā)育及泌乳重要功能基因的篩選.pdf

1、奶牛是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，奶牛的乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)是衡量養(yǎng)殖水平和經(jīng)濟(jì)效益的重要標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)雖是世界奶牛養(yǎng)殖大國(guó)，但奶牛的年平均單產(chǎn)低于世界平均水平。乳脂率和乳蛋白含量也相對(duì)較低，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的消費(fèi)需求。乳是由乳腺自身合成和分泌的，乳腺發(fā)育及泌乳過(guò)程中重要功能基因的表達(dá)變化是調(diào)節(jié)乳腺生長(zhǎng)、發(fā)育、分化以及乳汁合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)等重要生理過(guò)程的基礎(chǔ)。因此，對(duì)乳腺發(fā)育和泌乳重要功能基因的篩選及功能鑒定對(duì)奶牛遺傳性能的改善、促進(jìn)我國(guó)奶業(yè)的

2、發(fā)展有積極作用。
　　 奶牛乳腺在泌乳期是乳汁合成和分泌旺盛時(shí)期，受多種基因協(xié)同調(diào)節(jié)。為揭示奶牛乳腺在泌乳期相對(duì)于其他發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因，本實(shí)驗(yàn)采用Affymetrix公司的牛基因組表達(dá)譜芯片對(duì)荷斯坦奶牛不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選，并通過(guò)泌乳期同青春期、妊娠期和干乳期奶牛乳腺組織中基因表達(dá)情況的對(duì)比，獲得泌乳期奶牛乳腺基因表達(dá)譜，同時(shí)使用熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，泌乳期與青春期、妊娠期及干乳

3、期奶牛乳腺對(duì)比，共篩選出差異表達(dá)基因567個(gè)，其中泌乳期高表達(dá)基因163個(gè)，泌乳期低表達(dá)基因404個(gè)。熒光定量RT-PCR方法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證也顯示出與芯片結(jié)果的一致性，表明通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選奶牛泌乳期差異表達(dá)基因結(jié)果準(zhǔn)確，可信度高。
　　 將篩選出的泌乳期特異性表達(dá)基因在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，獲得基因功能的生物學(xué)注釋。結(jié)果顯示：在泌乳期奶牛乳腺中高表達(dá)的基因功能很大程度上和乳腺在此階段的生理功能相聯(lián)系。泌

4、乳期奶牛乳腺組織篩選出的主要功能基因集中在乳汁的合成和分泌上，同時(shí)也有同組織發(fā)育相關(guān)的功能基因出現(xiàn)。
　　 將篩選出的在泌乳期差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，得到泌乳期相對(duì)于其他各時(shí)期活躍的信號(hào)通路，有助于對(duì)泌乳期乳腺中各種分子事件進(jìn)行解釋。
　　 根據(jù)基因芯片結(jié)果，在泌乳期高表達(dá)基因中選取Kcnmal和Ihh基因，對(duì)其在泌乳期的調(diào)控功能進(jìn)行驗(yàn)證。采用基因過(guò)表達(dá)技術(shù)和RNA干擾技術(shù)分別對(duì)Kcnmal和Ihh基因進(jìn)行正負(fù)調(diào)控

5、，分別增加和減少其在泌乳盛期奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)，采用Western Blot和流式細(xì)胞儀檢測(cè)Kcnmal和Ihh基因表達(dá)量發(fā)生變化后，乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)酪蛋白和磷酸化STAT5的表達(dá)變化，以及乳腺上皮細(xì)胞增殖活性變化。結(jié)果表明，Kcnmal基因有促進(jìn)乳蛋白合成的作用（P<0.05），Kcnmal基因還具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用（P<0.05）。Ihh基因?qū)θ橄偕掀ぜ?xì)胞酪蛋白合成影響不顯著（P>0.05），對(duì)細(xì)胞增殖影響不顯著（P>0.05