第一次證明了載有肺炎鏈球菌sⅲ型莢膜遺傳信息的物質(zhì)是dna。（二）

1、第八章 微生物的遺傳與變異,遺傳性：指生物的親代傳遞給其子代一套遺傳信息的特性?；蛐停褐干矬w所攜帶的全部基因的總稱。表型：指遺傳特性在一定環(huán)境條件下的具體表現(xiàn)。變異：指遺傳型的改變，即生物遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生改變。飾變：同樣遺傳型的生物，在不同的外界條件下呈現(xiàn)不同的表型。,第一節(jié) 微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),（一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 　　1944年美國洛克非勒醫(yī)學(xué)研究所的Avery等人證實(shí)了1928年英國人Griffith的發(fā)現(xiàn)，并將

2、肺炎鏈球菌SⅢ型的DNA成功的轉(zhuǎn)化無毒性的肺炎球菌RⅡ型為有毒的肺炎球菌SⅢ型，第一次證明了載有肺炎鏈球菌SⅢ型莢膜遺傳信息的物質(zhì)是DNA。,（二）噬菌體的感染實(shí)驗(yàn) 　　1953年美國人Hershey和Chase用放射性同位素方法，提供了DNA是噬菌體遺傳物質(zhì)的直接證據(jù)。他們用含32P和35S的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌H，再用被標(biāo)記的大腸桿菌Ｈ培養(yǎng)Ｔ2噬菌體，直至完全標(biāo)記上32P和35S的T2噬菌體為止。用標(biāo)記的T2噬菌體侵染沒有標(biāo)記的大

3、腸桿菌Ｈ，結(jié)果表明，Ｔ2噬菌體外殼蛋白中有35S放射性并與細(xì)菌的細(xì)胞壁連接，而DNA部分則有32P放射性并進(jìn)如細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中。這一事實(shí)說明，在噬菌體侵染細(xì)菌過程中蛋白質(zhì)外殼留在細(xì)菌細(xì)胞外，只有DNA進(jìn)入了細(xì)胞，又一次證明遺傳物質(zhì)是DNA，而不是蛋白質(zhì)。,（三）病毒拆開和重建實(shí)驗(yàn) 　　通過Fraenbkel－Conrat等在植物病毒領(lǐng)域中的著名實(shí)驗(yàn)，證明RNA是煙草花葉病毒的遺傳物質(zhì)。,第二節(jié) 微生物突變 突變（mu

4、tation）指遺傳物質(zhì)--核酸（DNA或RNA）中的核苷酸順序突然發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化。突變包含基因突變和染色體畸變，基因突變是由于DNA鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變而引起的。,一、基因突變的自發(fā)性和突變結(jié)果與原因不對應(yīng)性的證明 人們通常認(rèn)為，某種細(xì)菌從對藥物敏感到產(chǎn)生抗性是由于藥物長期作用于細(xì)菌的結(jié)果，但實(shí)際上，對藥物的這種抗性突變與接觸藥物無關(guān)，即突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應(yīng)關(guān)系。后來，人們通過幾個(gè)嚴(yán)密

5、的科學(xué)實(shí)驗(yàn)后終于證明，在接觸抗性因子之前便已出現(xiàn)了抗性菌落。最著名的實(shí)驗(yàn)有：變量試驗(yàn)、涂布試驗(yàn)、影印培養(yǎng)試驗(yàn),（一）變量試驗(yàn) 1943年，魯里亞（S.E.Luria）和德爾波留克（M.Delbruck）首先設(shè)計(jì)。其要點(diǎn)是：先將大腸桿菌液分成等量的兩部分。一部分裝在大試管里，另一部分裝在50支小試管里，將大小試管里的大腸桿菌放在恒溫箱里培養(yǎng)，經(jīng)過24到60小時(shí)后分別接種到固體培養(yǎng)基上。一只大試管分接50副培養(yǎng)皿，而50支小試管，每

6、支接一副培養(yǎng)皿。每皿固體培養(yǎng)基里有等量的噬菌體，能生長的大腸桿菌是抗噬菌體的突變體。所得結(jié)果是，從一支大試管里長出來的菌落，也就是抗噬菌體的數(shù)量比較一致，即使有差異，也僅僅是實(shí)驗(yàn)上的誤差。而由50支小試管長出來的抗噬菌體菌落，在數(shù)量上的差異較大。這說明抗噬菌體突變體是在接觸噬菌體前在一次細(xì)胞分裂過程中隨機(jī)自發(fā)產(chǎn)生的。這一自發(fā)突變發(fā)生得越早，則抗噬菌體菌落出現(xiàn)得越多，反之越少。抗噬菌體突變體的出現(xiàn)與是否接觸噬菌體無關(guān)。,（二）涂布試驗(yàn)

7、 1949年Newcombe設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，其要點(diǎn)：在12個(gè)平板上涂上數(shù)目相等的敏感于T1噬菌體的大腸桿菌，經(jīng)5小時(shí)的培養(yǎng)，在皿上長出大量的微菌落，取其中6皿直接噴上T1噬菌體，另6皿則先用滅菌玻棒把微菌落重新均勻涂布一次后同樣噴上等量的T1噬菌體，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，涂布過的一組有抗性菌落353個(gè)，比未涂布過的（僅28個(gè)菌落）高得多。這說明該抗性突變發(fā)生在未接觸噬菌體前，噬菌體的加入不是誘導(dǎo)突變的因素。,（三）影印培養(yǎng)試驗(yàn) 所謂影印

8、培養(yǎng)法，實(shí)質(zhì)上是使在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法。1952年J.Lederberg夫婦首先進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，是通過使菌不接觸抗性環(huán)境而檢查其抗性菌落出現(xiàn)的方法來證明的。方法要點(diǎn)是：包有滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱（直徑略小于培養(yǎng)皿底）為印章，用不具抗性環(huán)境（如不加抗生素等）的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以印章輕輕粘取菌落，然后再一一接種到不同的選擇培養(yǎng)基（如含有不同抗生素等）上，培養(yǎng)后，對各培養(yǎng)皿相同位置上的菌落作比較，便可選出相

9、應(yīng)的突變型菌落。,二、自發(fā)突變自發(fā)突變：指微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的突變。自發(fā)突變可能的機(jī)制： （一）背景輻射和環(huán)境因素的誘變  例如：充滿宇宙空間的各種短波輻射、高溫的誘變效應(yīng)以及自然界中存在的誘變物質(zhì)的作用。由于長期受到原因不詳?shù)恼T變因素的綜合效應(yīng)，便發(fā)生自發(fā)突變。 （二）微生物的代謝產(chǎn)物的誘變  通常存在于細(xì)胞內(nèi)的天然物質(zhì)，如：過氧化氫、咖啡堿、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮絲氨酸等。它們既是微

10、生物的代謝產(chǎn)物，又可以引起微生物的自發(fā)誘變。 （三）環(huán)出效應(yīng)  在DNA復(fù)制的過程中，如果其中某一單鏈上偶爾產(chǎn)生一小環(huán)，則會(huì)因其上的基因越過復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失，從而造成自發(fā)突變。,三、誘發(fā)突變（一）物理因素的突變 1.紫外線  紫外線的大劑量作用可導(dǎo)致菌體死亡，小劑量則可引起突變。其主要生物學(xué)效應(yīng)是其對DNA的作用。其中主要機(jī)制是胸腺嘧啶二聚體的形成，它可在同一條鏈或兩條鏈上發(fā)生。但發(fā)現(xiàn)形成的復(fù)合物暴露在可

11、見光下，會(huì)使胸腺嘧啶二聚體重新解聚成為單體，此過程稱為光復(fù)活作用。在紫外線照射進(jìn)行誘變育種工作時(shí)，必須在紅光下進(jìn)行處理或操作，并在黑暗條件下培養(yǎng)，以免發(fā)生光復(fù)活作用。,2.X射線和γ射線 X射線和γ射線是不帶電的光量子，不能直接引起物質(zhì)電離，但在與原子或分子碰撞時(shí)，能把全部能量或部分能量傳給原子而產(chǎn)生次級(jí)電子，這些次級(jí)電子具有很高的能量，使產(chǎn)生電離作用，從而直接或間接的改變DNA的結(jié)構(gòu)。其直接效應(yīng)是使堿基間、DNA間、糖與磷酸

12、間相接的化學(xué)鍵斷裂；間接效應(yīng)是，電離作用引起水或有機(jī)分子產(chǎn)生自由基作用于DNA分子，導(dǎo)致缺失或損傷。,（二）化學(xué)因素的誘變 1.堿基結(jié)構(gòu)類似物   這是一類與正常堿基結(jié)構(gòu)（A、T、C、G）相似的物質(zhì)，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-脫氧尿嘧啶（5-dU）、8-氮鳥嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤等，它們能摻入DNA分子中而不妨礙DNA的正常復(fù)制，但其發(fā)生的錯(cuò)誤配對便可引起堿基對的置換，出現(xiàn)突變。這類代謝類似物只有對正常

13、進(jìn)行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對休止細(xì)胞，游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。,2.與核酸上堿基起化學(xué)反應(yīng)的誘變劑   有些化合物能與DNA分子的某些基團(tuán)起化學(xué)反應(yīng)，如亞硝酸可使堿基脫氨，脫去的氨基被羥基取代，從而使A、G、C分別轉(zhuǎn)變成H（次黃嘌呤）、X（黃嘌呤）、U（尿嘧啶），復(fù)制時(shí)它們便與C、G、A配對。,3.移碼誘變   吖啶類化合物,如原黃素、吖啶橙、吖啶黃、a-氨基吖啶等是

14、一類染料，具有扁平結(jié)構(gòu)，能插入到DNA分子的堿基對之間，使DNA結(jié)構(gòu)變形，在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生不對稱交換，從而引起在DNA鏈中插入或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，造成這一對核苷酸以后所有密碼發(fā)生移動(dòng)，產(chǎn)生移碼突變。,四、誘變育種 誘變育種是指通過人工方法處理微生物，使之發(fā)生突變，并運(yùn)用合理的篩選程序和方法，把適合人類需要的優(yōu)良菌株選育出來的過程。,第三節(jié) 基因重組   把兩個(gè)不同性狀的個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子的重

15、新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組（gene recombination）。    原核微生物的基因重組方式主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等形式。,一、轉(zhuǎn)化（transformation） 受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化（transformation)。轉(zhuǎn)化后的受體菌，就稱轉(zhuǎn)化子（transformant）。

16、 受體菌：只有處于感受態(tài)的細(xì)菌才能吸收外源DNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。細(xì)菌的感受態(tài)是一種生理狀態(tài)，它可以通過感受態(tài)因子，一種蛋白質(zhì)因子在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移而獲得；也可由某些生長條件誘導(dǎo)而成，如受體菌由豐富培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到貧瘠培養(yǎng)基時(shí)約15%的枯草桿菌進(jìn)入感受態(tài)。也與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，如肺炎球菌的感受態(tài)出現(xiàn)在對數(shù)期后的40min。,轉(zhuǎn)化過程示意圖,二、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）   通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把一個(gè)細(xì)胞（供體

17、細(xì)胞）的DNA片段轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（受體細(xì)胞）中，并使后者發(fā)生遺傳變異的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得部分供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體或轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。在噬菌體內(nèi)僅含有供體DNA的稱為完全缺陷噬菌體；在噬菌體內(nèi)同時(shí)含有供體DNA和噬菌體DNA的稱為部分缺陷噬菌體（部分噬菌體DNA被供體DNA所替換）。,三、接合（conjugation)

18、 通過供體菌和受體菌完整細(xì)胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過程，稱為接合(conjugation)。 接合菌株與F因子 在細(xì)菌中，接合現(xiàn)象研究的最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌有性別分化。決定其性別的因子是F因子（即致育因子或稱性質(zhì)粒），這是一種在染色體外的小型獨(dú)立環(huán)狀DNA單位。F因子是一種屬于附加體（episome）的質(zhì)粒，它既可脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（即整合）到染色體組上。由于F因子在細(xì)胞中的有無和存

19、在方式的不同，可把大腸桿菌分成4種接合類型：F+（雄性菌株）、F-（雌性菌株）、Hfr（高頻重組菌株），F(xiàn)'菌株。,F因子的存在和轉(zhuǎn)移方式,（三）幾種雜交結(jié)果 1、F+菌株和F-菌株接合的結(jié)果是產(chǎn)生二個(gè)F+菌株。 2、F'菌株和F-菌株接合的結(jié)果是產(chǎn)生二個(gè)F'菌株。 3、Hfr菌株和F-菌株接合，在大多數(shù)的情況下，受體細(xì)菌仍然是F-，只有在極少數(shù)的情況下，由于遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移完整，受體細(xì)菌才能成為Hfr菌株。,

20、第四節(jié) 基因工程   基因工程（gene engineering）指基因水平上的遺傳工程，它是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)（DNA大分子）提取出來，在離體條件下進(jìn)行切割后，把它和作為載體的DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，以讓外來的遺傳物質(zhì)在其中"安家落戶"，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新的物種的一種嶄新的育種技術(shù)。,一、基因分離1、提取供體細(xì)胞的DNA，加入專一

21、性很強(qiáng)的限制性核酸內(nèi)切酶，從而獲得帶有特定基因并露出稱為黏性末端的DNA。2、提供作為載體的細(xì)菌質(zhì)粒（也可用噬菌體或病毒作載體）。其中DNA也可用同樣的限制性核酸內(nèi)切酶切斷，露出其相應(yīng)的黏接末端。二、體外重組  把供體細(xì)胞的DNA片段和質(zhì)粒DNA片段放在試管中，在較低的溫度（5～6℃）下混合“退火”，當(dāng)兩者混合在一起時(shí)，凡粘接末端上堿基互補(bǔ)的片段，就會(huì)因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鍵。這時(shí)，在外加連接酶的作用下，

22、供體DNA片段與質(zhì)粒DNA片段的裂口處被“縫合”，形成一個(gè)完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組體，及“雜種質(zhì)?！薄?三、載體傳遞 通過載體把供體的遺傳基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)。載體必須具有自主復(fù)制的能力。 四、復(fù)制表達(dá)  “雜種質(zhì)?！边M(jìn)入受體細(xì)胞后，能通過自主復(fù)制而得到擴(kuò)增，并使受體細(xì)胞表達(dá)出為供體細(xì)胞所固有的部分遺傳性狀，成為“工程菌”。 五、篩選、繁殖  重組后的"雜種質(zhì)粒"的性狀是否

23、符合原定"藍(lán)圖"，以及它能否在受體細(xì)胞內(nèi)正常增殖和表達(dá)等還需要經(jīng)過仔細(xì)檢查，以便能在大量個(gè)體中設(shè)法篩選出所需要性狀的個(gè)體，然后才可加以繁殖和利用。,第五節(jié) 菌種退化、復(fù)壯和保藏 在微生物的研究中，要保持一個(gè)優(yōu)良菌株的遺傳穩(wěn)定性是一件艱苦的工作。菌種退化就是一種潛在的威脅。,一、菌種退化現(xiàn)象  菌種退化（degeneration）指群體中退化細(xì)胞在數(shù)量上占一定數(shù)值后，表現(xiàn)出菌種生產(chǎn)性能下降的現(xiàn)

24、象。常表現(xiàn)為，在形態(tài)上的分生孢子減少或顏色改變，甚至變形；在生理上常指產(chǎn)量的下降。,二、退化菌種的復(fù)壯   因?yàn)樵谕嘶木N中仍有一些保持原有菌種特性的細(xì)胞，故有可能采取一些相應(yīng)措施，使這些細(xì)胞生長、繁殖，以更新退化的菌株，稱之為菌種的復(fù)壯。常用的方法是單細(xì)胞分離、純化、擴(kuò)大培養(yǎng)。,,,三、菌種的保藏 經(jīng)誘變篩選、分離純化以及純培養(yǎng)等一系列艱苦勞動(dòng)得到的優(yōu)良菌株，能使其穩(wěn)定的保存、保持原有的特性、不死亡、不污

25、染，這就是菌種保藏的任務(wù)。 （一）原理 人為地創(chuàng)造合適的環(huán)境條件，使微生物的代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工環(huán)境主要從低溫、干燥、缺氧三方面設(shè)計(jì)。 （二）常用方法 1、斜面保藏法 將菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間再轉(zhuǎn)接到新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏。此方法簡單、存活率高，故應(yīng)用較普遍。其缺點(diǎn)是菌株仍有一定的代謝強(qiáng)度，傳代多則菌種易變異，故不宜長時(shí)

26、間保藏菌種。,2、液體石蠟覆蓋保藏法 為了防止傳代培養(yǎng)菌因干燥而死亡，也為限制氧的供應(yīng)以削弱代謝水平，在斜面或穿刺的培養(yǎng)基中覆蓋滅菌的液體石蠟。本法的優(yōu)點(diǎn)是方法簡單不需特殊裝置。3、載體保藏法   使微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體上（土壤、沙子等）進(jìn)行干燥保存的方法。最常用的有土壤保藏法。主要用于能形成孢子或孢子囊的微生物的保存。此方法簡便，保藏時(shí)間長，微生物轉(zhuǎn)接也較方便，故應(yīng)用范圍較廣。,4、懸液保藏法

27、使微生物混懸于適當(dāng)媒液中加以保藏的方法，其中蒸餾水保藏法較為常用。酵母菌、霉菌和放線菌的大部分均適用此法保存。操作方法簡便。 5、寄主保藏法 某些微生物只能寄生在活著的動(dòng)物、植物或細(xì)菌中才能繁殖傳代，故可針對寄主細(xì)胞或細(xì)胞的特性進(jìn)行保存。如噬菌體可以經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)大后，與培養(yǎng)基混合直接保存。,6、冷凍干燥保藏法 這是最佳的微生物保存法之一，保存時(shí)間長。低溫冷凍可以用普通-20 ℃或更低的-50 ℃、-70 ℃冰箱，