dna重組技術基本工具

1、布雷斯塔警長,鷹的眼睛,狼的耳朵,豹的速度,熊的力量,1.1DNA重組質技術的基本工具,專題一：基因工程,基因拼接技術或DNA重組技術,生物體外,基因,DNA分子水平,人類需要的基因產物,剪切,→ 拼接,→ 導入,→ 表達,基因重組,基因工程,基因工程操作的四個基本步驟,1）提取目的基因2）目的基因與運載體結合3）將目的基因導入受體細胞4）目的基因的檢測和表達,基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：,普通棉花(無抗蟲基因),蘇云金芽孢桿菌

2、,,提取,抗蟲基因,與運載體DNA拼接導入,,,,棉花細胞(含抗蟲基因),轉基因棉花植株,上述培育抗蟲棉的關鍵步驟是什么？,,,,,,剪刀限制性核酸內切酶,針線DNA連接酶,,運載體,所需工具,識別某種雙鏈DNA分子____________，使每一條鏈中兩個核苷酸之間的____________斷開。(具專一性),主要是從__________中分離純化出來的。,約4000種,1、來源：2、種類：3、作用：4、結果：

3、5、命名,形成兩種末端,,黏性末端,平末端,原核生物,特定的核苷酸序列,磷酸二酯鍵,P7問題2,一、限制性內切酶,,“分子手術刀”,2. 簡式: A — P ～ P ～ P,,,腺苷,磷酸基團,高能磷酸鍵,30.54KJ/mol,1. 中文全稱: 三磷酸腺苷,ATP分子中具有高能磷酸鍵,一分子ATP中含有的腺苷、高能磷酸鍵和磷酸基團的數(shù)目依次為A、1，3，2 B、1，2，1

4、 D、2，3，1,C、1，2，3,ATP的水解過程,A–P～P P,,為生命活動提供能量,細胞分裂、營養(yǎng)物質吸收神經系統(tǒng)活動、肌肉收縮,,～,,1、組成元素：,三、核酸的分子結構,2、基本單位：核苷酸,,,脫氧核糖核苷酸,,核糖核苷酸,3、核苷酸鏈,,脫氧核糖核苷酸鏈——2條核糖核苷酸鏈——1條,,4、核酸,,DNARNA,C、H、O、N、P,核酸,,水解,核苷酸,核苷酸分子簡式,兩種核苷酸比較,,,五碳糖為

5、脫氧核糖時為脫氧核糖核苷酸（簡稱脫氧核苷酸） 五碳糖為核糖時為核糖核苷酸,,DNA,RNA,,,,,,堿基的種類,腺嘌呤 A 鳥嘌呤 G 胞嘧啶 C 胸腺嘧啶 T 尿嘧啶 U,核酸中共有多少種堿

6、基？,DNA,RNA,DNA: A . G . C . T,RNA: A . G . C . U,T,磷酸二酯鍵,,A,,大腸桿菌(EcoRI)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。,,限制酶,,,,,,EcoRI限制酶的切割：,,,,,中軸線,黏性末端,黏性末端,,,,,在G與A之間切割,大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。,,黏性末端：被限制酶切開的DNA兩條

7、單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,平末端是如何形成的？,當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。,,,SmaI限制酶的切割：,只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。,當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，產生的是平末端。,當限制酶從識別序列的中心軸線兩側切開時，產生的是黏性末端。,要想獲得某個目的基因必須要用限

8、制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？一個目的基因有幾個黏性末端？,要切兩個切口，產生四個黏性末端，兩個。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？,會產生相同的黏性末端。,是不是把兩者的黏性末端黏合起來，這樣就真的合成 重組的DNA分子了?,實際還不夠,還需要DNA連接酶進行連接。,思考題：,二、 DNA連接酶—— “分子縫合針”,1、種類：2、作用部位：3、結果：,兩類,磷酸二酯鍵,兩個相同的黏

9、性末端的連接,連接黏性末端,連接黏性末端和平末端,DNA連接酶連接黏性末端之間的 磷酸二酯鍵，形成重組的DNA分子。,,,DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同點和不同點？,三、基因進入受體細胞的載體 —“分子運輸車”,常用的運載體主要有兩類： 1）細菌細胞質的質粒 2）噬菌體或某些動植物病毒,運載體條件：,1.能夠在宿主細胞內復制并穩(wěn)定保存；2.具有多個限制酶切點以便與外源基因相連；3.具有標記基因，如抗

10、四環(huán)素的抗性基因。便于進行鑒定和篩選．4.對受體細胞無害，容易分離，大小合適,,能帶著插入的目的基因一起復制,,有切割位點,,標記基因的作用鑒別受體細胞中是否含目的基因。如將來可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別，將含目的基因的細胞篩選出來。,,運載體的作用:,一：將外源基因轉移到受體細胞中。二：利用運載體在受體細胞內，對外源基因進行復制。,,噬菌體侵染細菌的動態(tài)過程：,,,,,,侵入別的細菌,注入DNA,合成,吸附,組裝,釋放,1.以下說法正

11、確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、DNA連接酶使黏性末段的堿基之間形成氫鍵,C,練習,2.不屬于質粒被選為基因運載體的理由是 A、能復制 （

12、 ） B、有多個限制酶切點 C、具有標記基因 D、它是環(huán)狀DNA,D,練習,,下列四個DNA分子片段，可能是同一種限制性內切酶切割產生的黏性末端的一組是A．①② B．②③ C．③④ D．②④,D,3.有關基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、基因工程技術能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種 B、重組DNA的形成在細胞內完成 C、目的基因須由運載體導

13、入受體細胞 D、質粒都可作為運載體,B D,練習,練習,4、在基因工程中，切割運載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ）同種限制酶 B. 兩種限制酶同種連接酶 D. 兩種連接酶5、基因工程常用的受體細胞有（ ）(1)大腸桿菌 （2）枯草桿菌（3）支原體 （4）動植物細胞A. （3）（4） B. （1）（2）（4）C.

14、 （2）（3）（4） D. （1）（2）（3）,,,,6、 基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結合 C、將目的基因導入受體細胞 D、目的基因的檢測和表達,C,練習,2和7能連接形成…AC

15、GT…               …TGCA…；4和8能連接形成…GAATTC…              …CTTAAG…；

16、3和6能連接形成…GCGC…              …CGCG…；1和5能連接形成…CTGCAG…              …GAC

17、GTC…。,教材P7思考與探究1,2. 生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵 。,3.提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質粒，即獨立于細菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是

18、否任何質粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。（1） 載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。（2） 載體DNA必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。（3） 載體DNA必需帶有標記基因，以便重

19、組后進行重組子的篩選。（4） 載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。（5） 載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。,作業(yè)：,一、基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設計,通過體外____和____等技術,賦予生物以心得遺傳特性,創(chuàng)造出符

20、合人們的需要的新的____和____.又叫做DNA的重組技術 .二、DNA重組技術的基本工具 1.限制性核酸內切酶-----”分子手術刀” (1)主要來源:從____生物中分離出來的. (2)特點:能夠識別DNA特定的核苷酸序列,切開,兩個____之間的_____ . (3) DNA末端:限制酶切割DNA產生的DNA末端有兩種形式:______和_______. 2. DNA連接酶--

21、--”分子縫合針” (1)作用:將雙鏈DNA____,恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的______. (2)種類: ①E.coli DNA連接酶:只能縫合DNA的_____ ②T4 DNA連接酶:既可縫合DNA的_____,又可縫合雙鏈DNA的_______.,3.基因進入受體細胞的載體----”分子運輸車” (1)載體的種類 ①質粒:是一種裸露的,結構簡單,獨立于細菌染色體之外,并能夠