酶傳感基礎(chǔ)

1、酶固定化與反應(yīng)酶固定化與反應(yīng)?酶，是特異性生物催化劑。酶蛋白＋輔助因子（即：輔酶，輔基，或金屬離子）→全酶?酶分類：氧化還原酶(如：E.C.1.1.3.4：葡萄糖氧化酶)轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂解酶，異構(gòu)酶，連接酶?酶活性：以在規(guī)定條件下，每分鐘能催化轉(zhuǎn)化1微克分子的底物所需要的酶量為一個活性單位性單位。常以Unitemg或UnitemL為單位。不同公司生產(chǎn)的酶活性定義不同，不好直接比較。?酶催化反應(yīng)動力學(xué)過程：PEESSEKkk??????

2、?211，SkkkSEkvtotal????1212)(SKVSvm??，稱為米氏常數(shù)，V＝k2Etotal121)(kkkKm???叫做最大速度，當v=V2時Km＝S，所以米氏常數(shù)是反應(yīng)速度反應(yīng)速度為最大速度一半時底物的濃度?？梢娒资铣?shù)越小說明底物濃度很小時酶仍能保持高的反應(yīng)速度，也就是酶活性越高。（注意，米氏常注意，米氏常數(shù)并不是最大可檢測的底物濃度的一半，而是反應(yīng)速度為數(shù)并不是最大可檢測的底物濃度的一半，而是反應(yīng)速度為最大速度一

3、半時最大速度一半時底物的濃度。）變化為線性形式：，VSVKvm111???根據(jù)此方程可算米氏常數(shù)。在電化學(xué)中用電流代替反應(yīng)速度可寫成：，斜率為Kmmaxmax11ISIKIm??Glucoseoxidase（GoxGOD）的反應(yīng)）的反應(yīng)：GOD：MW：186000，（sigma，niger），從黑曲霉素提取的GOD分子量不同，Km一般為9.610－3－3.3102M，4度下能穩(wěn)定612個月干粉0℃下可保存2年15℃下可保存8年。pH為5

4、.5時活性最大。等電點：pH＝4.2GOD＝酶蛋白＋FAD（黃素二核苷酸，是活性中心和氧化還原中心）總反應(yīng)：222OHacidGluconicOseGlucGOD???????分步反應(yīng)：2FADHacidGluconicseglucFAD????第一代生2222OHFADOFADH???物傳感器缺點：受溶解氧含量2222OOHOHe?????影響第二代：不用氧2FADHacidnicglucseglucFAD?????redoxMFAD

5、MFADH???2M：為二茂鐵、天青I等氧還劑，MMered????缺點：介體固定困難，泄漏第三代：2cosFADHacidgluconicegluFAD???FADCNT(2????eFADH，導(dǎo)電高分子作用下）在納米例子，為何要用酶傳感？為何要用酶傳感？使無電響應(yīng)的物質(zhì)有響應(yīng)，使響應(yīng)慢的響應(yīng)快，使廣泛的響應(yīng)變?yōu)樘禺愋缘捻憫?yīng)。以上三類都涉及酶的固定化酶的固定化，如何固定酶于電極表面？程瓊，嘉興高等?？茖W(xué)校學(xué)報1999，12（2）404

6、3吸附法，包埋法，交聯(lián)法（戊二醛），載體耦聯(lián)法，載體載體很重要，要求量大，活性高，保存時間長。納米SiO2，有序Al2O3孔，不同大小的金膠納米例子的影響，殼聚糖改性，CNT修飾，環(huán)糊精可能大大改善酶固定化后的活性（但是一定要求是納米級）。如何研究如何研究酶電極反應(yīng)？1.活性，可以分別在buffer和glucose中慢掃線性伏安法（穩(wěn)態(tài)）觀察電流大小，斜率2.響應(yīng)，攪拌下恒電位加樣，做“臺階”；或不攪拌在不同glucose濃度中測恒電位

7、測穩(wěn)態(tài)電流，或以不同glucos中峰高為響應(yīng)。在線性范圍內(nèi)可計算Km3.關(guān)于除氧，要看原理。關(guān)于電位范圍，要看原理。4.作用機制，光譜：UV，IR，AFM，SECM等表征如：Au納米＋GOD——活性增強，Au的UV，GOD的UV，Au納米＋GOD的UV，－IR（或SERS）光譜變化說明結(jié)合的鍵，AFM看看形貌，SECM算算電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)。FAD的結(jié)構(gòu)：I[Glucose]ImaxIGlucoseGluconicacidO2H2O2Gl

8、uconicacidMredMredGlucoseGluconicacidGlucose分子導(dǎo)線酶的固定化在生物傳感器中的應(yīng)用酶的固定化在生物傳感器中的應(yīng)用?傳感器類型：?電化學(xué)生物傳感器基本原理：如下圖，?固定化技術(shù)決定著酶生物傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性，其應(yīng)滿足以下條件（3S）：保持良好的生物活性sensitive；酶層與換能器緊密接觸；酶層具有良好的穩(wěn)定性stable；減少酶層中生物組分的相互作用以保持其原有的高度選擇性ive

9、。?酶的固定化方法:吸附法包埋法交聯(lián)法共價鍵結(jié)合1.吸附法酶的物理或化學(xué)吸附是一種簡單的固定化技術(shù)，條件溫和，可保持酶的生物活性。通過酶分子的極性鍵、氫鍵或疏水鍵作用，將酶吸附于不溶性載體上?？晒┻x擇的載體包括天然或人工合成的無機與有機高分子材料等，如再生絲素、凝膠樹脂、多孔SiO2、分子篩等。缺點是酶與固體表面結(jié)合力弱，在表面上進行任意取向的不規(guī)則分布，使制得的生物傳感器易發(fā)生酶的泄漏，靈敏度低。2.包埋法包埋法一般是采用凝膠聚合物包

10、埋，將酶包埋于聚合物膠、膜或表面活性劑基底中，是較為直接、更接近生物體的一種固定化方式。直接將酶混入石墨粉中進行包埋。電聚合高分子包埋法是通過將導(dǎo)電高分子單體和酶混合溶解于電解液內(nèi)，在電解聚合生成導(dǎo)電聚合物膜的同時，可以將酶包埋于高分子聚合物膜內(nèi)，直接固定于電極表面。導(dǎo)電高分子聚合物的典型代表有聚吡咯（PPy），聚苯胺（PAn）和聚噻吩（PTh）等。將酶包埋在類脂層中。3.交聯(lián)法交聯(lián)法是在溫和的條件下，游離酶的氨基酸殘基與雙官能團或多功

11、能團交聯(lián)劑反應(yīng)而被固定化，可獲得酶蛋白單位濃度較高的固定化酶。最常用的交聯(lián)試劑為戊二醛，與蛋白質(zhì)的自由氨基反應(yīng)，其原理反應(yīng)式如下：載體—NH2OHC(CH2)3CHONH2—酶—→載體—NHCH(OH)(CH2)3CH(OH)NH—酶—常用的載體有硅膠，尼龍，聚酰胺膜。該法的缺點主要有：反應(yīng)難以控制，形成的酶蛋白層膨松，堅固性差，所需生物樣品量多，擴散阻力大以及酶蛋白在多分子的固化層中活性降低。4.共價鍵結(jié)合將酶通過共價鍵與電極表面結(jié)合

12、而固定的方法稱為共價鍵合法，通常要求在低溫、低離子強度和生理pH條件下進行，當共價鍵在生物分子的非活性部位鍵合時，被固定的生物分子仍能保持較高的活性。通過共價鍵合法固定的酶具有良好的穩(wěn)定性。共價鍵合法的過程通常包括三個步驟：a.基體電極表面的活化；b.酶的偶聯(lián)；c.除去鍵合疏松的酶。共價鍵合法存在的問題主要有：共價鍵合反應(yīng)使酶的活性損失較大，且操作過程復(fù)雜。共價鍵合的主要方法：a.碳二亞胺縮合法b.重氮鹽偶聯(lián)法c.混合酸酐法d.琥珀酰亞

13、胺活化法e.過碘酸鹽氧化法?酶的自組裝：?酶的結(jié)構(gòu)1.MicroperoxidaseMP11(1.9kDa)redoxproteinobtainedbyproteolyticdigestionofhsecytochromec.2.Cytochromecisahemecontainingredoxprotein(34kDa)OpticalElectrochemicalPiezoelectricalThermalAmperometricPo