醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的新挑戰(zhàn)

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的新挑戰(zhàn),湖南省第二人民醫(yī)院 尹鐵球,OUTLINE,微生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史感染性疾病與人類(lèi)自動(dòng)化儀器的進(jìn)展分子生物學(xué)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用 細(xì)菌鑒定及分類(lèi) 耐藥性檢測(cè)病毒變異的臨床意義,微生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史,經(jīng)驗(yàn)微生物學(xué)時(shí)期實(shí)驗(yàn)微生物學(xué)時(shí)期現(xiàn)代微生物學(xué)時(shí)期,認(rèn)識(shí)微生物的歷程,微生物的發(fā)現(xiàn)微生物學(xué)的開(kāi)山鼻祖——列文虎克微生物學(xué)的奠基人——巴斯德醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的奠基人——科赫,微生物學(xué)的經(jīng)驗(yàn)

2、時(shí)期 (十七世紀(jì)上半葉以前) 利用微生物,古希臘時(shí)蒸酒,,,微生物在地球上存在了30多億年，人類(lèi)并不知道一直和微生物生死共處我國(guó)公元2000多年前就利用微生物釀酒許多疾病是由微生物引起的：11世紀(jì)肺癆我國(guó)17世紀(jì)初，吳有性醫(yī)生在《瘟疫論》中認(rèn)為傳染病是“乃天地間別有一種異氣所感”，并且指出“氣即是物，物即是氣”，肯定地預(yù)見(jiàn)有某種實(shí)體是傳染病的病原體我國(guó)18世紀(jì)，描述鼠疫,實(shí)驗(yàn)微生物學(xué)時(shí)期 (十七世紀(jì)下半葉至二十世紀(jì)初)

3、 1、微生物的發(fā)現(xiàn)和微生物形態(tài)學(xué)時(shí)期,,,,荷蘭人列文虎克(Leeuwenhoek)(1632-1723)是微生物學(xué)的先驅(qū),微生物學(xué)的開(kāi)山鼻祖 ——列文虎克,荷蘭人用自己制造的顯微鏡觀察到了被他稱為“小動(dòng)物”的微生物世界發(fā)現(xiàn)了桿菌、球菌和螺形菌實(shí)實(shí)在在看到并記錄了一類(lèi)從前沒(méi)有人看到過(guò)的微小生命因?yàn)檫@個(gè)偉大的發(fā)現(xiàn)，他當(dāng)上了英國(guó)皇家學(xué)會(huì)的會(huì)員,列文虎克觀察到的微生物,2、微生物生理學(xué)時(shí)期 建立了一套獨(dú)特的研

4、究方法,尋找各種傳染病病原菌,巴斯德在觀察受狂犬病感染的兔脊髓,,,,巴斯德在工作中,著名的巴斯德研究院,巴斯德在微生物學(xué)上的貢獻(xiàn),有機(jī)物發(fā)酵和腐敗由微生物引起解決葡萄酒和啤酒變酸問(wèn)題——?jiǎng)?chuàng)立巴氏消毒法解決蠶繭的“微粒子病”的疾病，挽救了法國(guó)蠶絲業(yè)主張傳染病是由微生物引起的，并可通過(guò)接觸、唾液及糞便傳播19世紀(jì)70年代，研究炭疽病，拯救了畜牧業(yè)1881年研制成功減毒活疫苗——開(kāi)創(chuàng)人類(lèi)戰(zhàn)勝傳染病的新世紀(jì)1885年，巴斯德第一次

5、治好了被瘋狗咬傷的9歲男孩梅斯特——奠定了免疫學(xué)基礎(chǔ),微生物方法學(xué)和醫(yī)學(xué)微生物學(xué)奠基人—— 科赫,科赫,1882年發(fā)現(xiàn)引起結(jié)核病的病原——分離出結(jié)核桿菌創(chuàng)立了微生物學(xué)檢查方法：固體培養(yǎng)技術(shù)、染色技術(shù)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌、霍亂弧菌總結(jié)了著名的“科赫法則” ---確立病原微生物1905年獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng),分離細(xì)菌的固體培養(yǎng)基,Koch氏確定病原體四要點(diǎn),在每一例患病的病人中，都應(yīng)找到此種微生物該微生物能

6、被分離，且能在純培養(yǎng)基中生長(zhǎng)培養(yǎng)出的微生物接種于易感動(dòng)物，一定能導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生該病在實(shí)驗(yàn)性發(fā)病動(dòng)物中，一定能觀察并重新獲得此種微生物,李斯特在石炭酸噴霧下進(jìn)行手術(shù),李斯特 無(wú)菌操作奠基人,伊凡諾夫斯基 病毒的發(fā)現(xiàn)者歐立希 （Ehrlich） 1910年砷凡納明抗梅毒藥的發(fā)現(xiàn)者,1929年青霉素發(fā)現(xiàn)者弗萊明1940年弗洛瑞提純應(yīng)用于臨床,弗萊明 研究微生物的生命活動(dòng),,,,Domagk發(fā)現(xiàn)黃胺藥,Griffith

7、發(fā)現(xiàn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,新病原微生物的確定方面1974年從萊姆(Lyme)病患者分得疏螺旋體1976年在美國(guó)費(fèi)城一次退伍軍人會(huì)議期間發(fā)生 肺炎流行,次年分離出軍團(tuán)菌1983年從慢性胃炎病人活檢標(biāo)本中分離出 幽門(mén)螺桿菌,現(xiàn)代微生物學(xué)時(shí)期,二十世紀(jì)中葉至今,1986年我國(guó)臺(tái)灣省分離得肺炎衣原體 1983年首先在美國(guó)發(fā)現(xiàn)人類(lèi)免疫缺陷病毒 （HIV） 近期新發(fā)現(xiàn)的病毒有腎綜合征出血熱病毒、新疆出血熱病毒、B 組輪

8、狀病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等,1973年以來(lái)認(rèn)識(shí)的病原體示例,年份 微生物 疾病1973 輪狀病毒 全球性嬰兒腹瀉的主要原因1976 小隱孢子蟲(chóng) 急性和慢性腹瀉1977 埃博拉病毒

9、 埃博拉出血熱1977 嗜肺性軍團(tuán)桿菌 軍團(tuán)病1977 Hantaan病毒 伴有腎綜合征的出血熱1977 空腸彎曲菌 全球散布的腸病1980 HTLV-I T細(xì)胞淋巴

10、瘤白血病1981 金葡萄菌產(chǎn)毒素株 中毒性休克綜合征1982 大腸桿菌O157：H7 出血性腸炎、溶血性尿毒癥1982 HTLV-II 毛細(xì)胞白血病1982 Burgdorferi螺旋體 萊姆病1983 HIV

11、 愛(ài)滋病1983 幽門(mén)螺旋桿菌 消化性潰瘍病1988 HEV 腸道傳播的非A、非B型肝炎1990 Guanarito病毒 委內(nèi)瑞拉出血熱1992 霍亂弧菌O139

12、 與流行性霍亂有關(guān)的新株1992 Hellem巴爾通氏體 貓抓病，桿狀血管瘤病1994 Sabia病毒 巴西出血熱2019 G型肝炎病毒（HGV） 非腸道傳播的非A、非B型肝炎2019 人類(lèi)皰疹病毒8型 與愛(ài)滋病有關(guān)的Kaposi肉瘤2019

13、 TSE致病因子 克羅伊茨非爾特-雅各布病的新變型2019 禽流感病毒A（H5N1） 流感,,湯飛凡發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體,,病原微生物的致病機(jī)制方面微生物基因組研究方面微生物檢測(cè)技術(shù)方面 防治病原微生物措施方面,感染性疾病與人類(lèi),人類(lèi)已經(jīng)宣布消滅的疾病：天花在某些地區(qū)已經(jīng)得到控制的疾?。郝檎?、脊髓灰質(zhì)炎、白喉、百日咳、結(jié)核、鼠疫正在流行的疾?。簜⒘?/p>

14、疾、病毒性肝炎、霍亂……,,感染性疾病與人類(lèi),新發(fā)生的傳染性疾病原有微生物的再發(fā),,一、新發(fā)生的傳染性疾病,1、原已存在但未被認(rèn)為是傳染病例如，消化性潰瘍 ,T細(xì)胞白血病,2、可能早已存在但未知,技術(shù)進(jìn)步發(fā)現(xiàn)或人畜接觸機(jī)會(huì)增加例如，丙型肝炎,萊姆病,3、過(guò)去確實(shí)不存在,由于微生物發(fā)生變異而產(chǎn)生例如， AIDS, O139 ,耐藥菌株,禽流感,SARS,,新發(fā)生的傳染性疾病的原因,人類(lèi)的不良行為——進(jìn)入以前未進(jìn)入的原始森林和地區(qū)

15、采礦 旅游 開(kāi)墾 嗜食野生動(dòng)物 寵物熱——性亂和吸毒氣候都市化——人口遷移 擁擠 易感人群增加 “貧民區(qū)”醫(yī)源性感染和濫用抗生素戰(zhàn)爭(zhēng) 貿(mào)易 水土流失微生物的持續(xù)不斷變異,新近認(rèn)識(shí)的致病微生物,禽流感病毒、SARS、H1N1、產(chǎn)NDM-1細(xì)菌……,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌,超級(jí)細(xì)菌?,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌：全稱“產(chǎn)Ⅰ型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（New Delhi Metallo-β-lactamase 1

16、, NDM-1）腸桿菌科細(xì)菌”，簡(jiǎn)稱“產(chǎn)NDM-1細(xì)菌”，是一種對(duì)多種抗菌藥物廣泛耐藥的細(xì)菌，主要為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌；特點(diǎn)：屬于腸桿菌科細(xì)菌，致病力與普通腸桿菌科細(xì)菌沒(méi)有差別；由于產(chǎn)生NDM-1導(dǎo)致廣泛耐藥，為“泛耐藥菌”；主要導(dǎo)致醫(yī)院感染；源于南亞地區(qū)，已在全球播散。,細(xì)菌耐藥概念,多重耐藥（multiple drug resistance, MRD）: 指細(xì)菌同時(shí)對(duì)三種以上結(jié)構(gòu)不同（作用機(jī)制不同）抗菌藥物耐藥，如頭

17、孢菌素、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)；泛耐藥（pan-drug resistance, PDR）:細(xì)菌對(duì)本身敏感的所有藥物耐藥；超級(jí)細(xì)菌（superbug）:并非科學(xué)概念，一般指PDR與部分MDR，沒(méi)有確切定義，以下細(xì)菌屬于此列：MRSA/VRSA;VRE;MDR-PA,PDR-AB;ESBL(+)+AmpC(+) 腸桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌（包括產(chǎn)NDM-1細(xì)菌）,細(xì)菌耐藥的危害,Cosgrove, et al.Clinical

18、Infectious Diseases 2019; 42:S82–9,產(chǎn)與不產(chǎn)ESBL大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比較,細(xì)菌耐藥的危害,肖永紅 等，抗生素類(lèi)藥物濫用公共問(wèn)題研究，2019,為什么需要關(guān)注產(chǎn)NDM-1細(xì)菌,泛耐藥導(dǎo)致的治療挑戰(zhàn)；多種腸桿菌科細(xì)菌發(fā)現(xiàn)；快速?gòu)哪蟻喌貐^(qū)傳播到歐美國(guó)家；不僅在醫(yī)院感染這種發(fā)現(xiàn)，同時(shí)社區(qū)感染這種發(fā)現(xiàn)。,,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌的發(fā)現(xiàn),2019年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中發(fā)現(xiàn)對(duì)碳青霉烯耐藥肺

19、炎克雷伯菌，該菌對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星也不敏感，僅對(duì)多粘菌素E敏感；該患者有多年糖尿病和中風(fēng)史，經(jīng)常往返于印度和瑞典之間，此前4月曾因臀部膿腫在印度住院治療，其后回到瑞典，因尿路感染再度入院；這株細(xì)菌攜帶一種新型金屬β-內(nèi)酰胺酶，研究人員根據(jù)患者感染地命名這種酶為NDM-1。,,南亞和英國(guó)流行情況,thelancet/infection Published online August 11, 2019 DOI:1

20、0.1016/S1473-3099(10)70143-2,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌種類(lèi),,傳播方式,醫(yī)院內(nèi)感染污染的醫(yī)療器械;污染的醫(yī)療用品;污染的手跨國(guó)傳播跨國(guó)醫(yī)療旅游,,,,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌感染臨床特點(diǎn),產(chǎn)NDM-1細(xì)菌主要表現(xiàn)為多重耐藥，致病力與敏感細(xì)菌沒(méi)有差別；主要引起醫(yī)院感染；有社區(qū)感染報(bào)道；感染危險(xiǎn)因素：危重患者，入住ICU；長(zhǎng)期住院患者；使用廣譜抗菌藥物，或長(zhǎng)期應(yīng)用抗菌藥物；插管或侵襲性操作；免疫抑制；呼

21、吸機(jī)應(yīng)用;……,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌感染臨床特點(diǎn),主要感染類(lèi)型：泌尿道感染；傷口感染；醫(yī)院肺炎；呼吸機(jī)相關(guān)肺炎；血流感染；導(dǎo)管相關(guān)感染； 感染表現(xiàn)沒(méi)有特別之處。碳青霉烯治療感染無(wú)效，提示該類(lèi)細(xì)菌感染可能，需要及時(shí)進(jìn)行檢查。,,實(shí)驗(yàn)室診斷,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌感染臨床表現(xiàn)與敏感菌沒(méi)有差異，臨床診斷困難；對(duì)碳青霉烯治療無(wú)效的陰性菌感染需要考慮這類(lèi)細(xì)菌感染可能；診斷主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果；實(shí)驗(yàn)室檢查分為三步：

22、 表型篩查-表型確認(rèn)-基因確證,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌表型篩查,美羅培南或亞胺培南紙片法（K-B法，10μg紙片）或最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定法對(duì)腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行初步篩查，達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)，需進(jìn)行表型確認(rèn)。 K-B法：美羅培南或亞胺培南抑菌圈直徑≤22mm。MIC測(cè)定法：美羅培南MIC≥2mg/L；或亞胺培南對(duì)大腸埃希菌、克雷伯菌屬、沙門(mén)菌屬和腸桿菌屬M(fèi)IC≥2mg/L。,亞胺培南,美羅培南,亞胺培南,美羅培南,產(chǎn)NDM

23、-1細(xì)菌表型確認(rèn),雙紙片協(xié)同試驗(yàn):采用亞胺培南(10μg)、EDTA（1500 μg） 兩種紙片進(jìn)行K-B法，兩紙片距離10-15mm，在含EDTA紙片方向處，亞胺培南抑菌圈擴(kuò)大，即可判定產(chǎn)金屬酶。,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌表型確認(rèn),采用亞胺培南（美羅培南）/EDTA復(fù)合紙片進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)，復(fù)合紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑增大值≥5mm；亞胺培南（美羅培南）/EDTA 復(fù)合E試條協(xié)同試驗(yàn)測(cè)定MIC，單藥與復(fù)合制劑的MIC比值≥8;即可判定產(chǎn)

24、金屬酶。,產(chǎn)NDM-1細(xì)菌基因確證,采用NDM-1的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序。,,PCR,測(cè)序,各醫(yī)院對(duì)陽(yáng)性結(jié)果須加以復(fù)核，同時(shí)菌株送有條件參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步檢測(cè)確證。,1.加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)NDM-1細(xì)菌監(jiān)測(cè),醫(yī)院重視臨床微生物檢驗(yàn)，提高細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)能力；臨床參考細(xì)菌檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用抗菌藥物；定期公布各醫(yī)院細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果；定期回顧細(xì)菌耐藥流行趨勢(shì)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常耐藥現(xiàn)象，早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)NDM-1細(xì)菌加以控制。,2.加強(qiáng)抗菌藥物合理使用監(jiān)

25、管,醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)有專門(mén)抗菌藥物合理使用管理小組，開(kāi)展教育、培訓(xùn)、監(jiān)督、檢查抗菌藥物使用情況；嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)管理規(guī)定，特別是抗菌藥物分類(lèi)管理規(guī)定。特殊使用抗菌藥物[衛(wèi)生部衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)(2009)38號(hào)]第四代頭孢菌素：頭孢吡肟、頭孢匹羅、頭孢噻利等；碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物：亞胺培南/西司他丁、美羅培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南等；多肽類(lèi)與其他抗菌藥物：萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素、替考拉寧、利奈唑胺等；抗真菌藥物：卡泊芬凈，米卡芬凈，伊

26、曲康唑（口服液、注射劑），伏立康唑（口服劑、注射劑），兩性霉素B含脂制劑等。,3.加強(qiáng)醫(yī)院感染的預(yù)防與控制,加強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員感染控制教育、培訓(xùn)，強(qiáng)化對(duì)NDM-1細(xì)菌等多重耐藥菌感染的預(yù)防、控制的認(rèn)識(shí)。在進(jìn)行各種侵襲性操作中，嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作。,,嚴(yán)格執(zhí)行《醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生規(guī)范》：醫(yī)療機(jī)構(gòu)必須提供充足的手衛(wèi)生設(shè)施。醫(yī)務(wù)人員在接觸病人前后、進(jìn)行侵入性操作前、接觸病人使用的物品或處理其分泌物、排泄物后，必須洗手或用含醇類(lèi)速干手消毒劑擦手。,3

27、.加強(qiáng)醫(yī)院感染的預(yù)防與控制,3.加強(qiáng)醫(yī)院感染的預(yù)防與控制,加強(qiáng)對(duì)重點(diǎn)部門(mén)尤其是ICU物體表面的清潔、消毒 。消毒劑：含氯消毒劑、0.5%過(guò)氧乙酸、2%戊二醛、0.5%醋酸環(huán)己啶-乙醇等；表面消毒方法：選擇不同消毒液擦拭或浸泡。,,3.加強(qiáng)醫(yī)院感染的預(yù)防與控制,隔離疑似或確診產(chǎn)NDM-1細(xì)菌感染或定植者，預(yù)防耐藥菌傳播。采用接觸隔離，將病人安置單獨(dú)房間，接觸患者時(shí)需要穿隔離衣、戴手套，相關(guān)醫(yī)療器械或物品如聽(tīng)診器、血壓計(jì)等專用，不能專用

28、的物品，需用后嚴(yán)格消毒。隔離期間需要定期檢測(cè)耐藥菌情況。,,二、原有微生物的再發(fā),病毒性疾病 狂犬病、登革熱、黃熱病寄生蟲(chóng) 瘧疾、血吸蟲(chóng)病、神經(jīng)囊尾幼病、棘阿米巴病、內(nèi)臟利氏曼病、弓形蟲(chóng)病、賈第蟲(chóng)病 、棘球幼病細(xì)菌性 A群鏈球菌、戰(zhàn)壕熱、鼠疫、白喉 、結(jié)核、百日咳、沙門(mén)菌屬、肺炎球菌、霍亂、多重耐藥菌株的流行,,多重耐藥菌株的流行,葡萄球菌腸球菌肺炎鏈球菌腸桿菌科結(jié)核分支桿菌,,多重耐藥

29、的結(jié)核桿菌,是指病人排出的TB至少已對(duì)INH和RFP產(chǎn)生耐藥或?qū)?種基本抗癆藥物（INH、RFP、鏈霉素、乙胺丁醇、砒嗪酰胺）中的兩種以上（包括兩種）耐藥者發(fā)生原因：?jiǎn)我换?、不合理化療、不?guī)律化療對(duì)策：合理化療，預(yù)防MTB出現(xiàn)加強(qiáng)檢測(cè)，及時(shí)檢出MTB 約有75%的臨床分離株存在RNA聚合酶β亞單位基因(rpo B)發(fā)生突變，對(duì)RFP耐藥,,腸桿菌科,對(duì)三代頭孢菌素耐藥的腸桿菌科在臨床大量出現(xiàn)主要耐藥機(jī)制:產(chǎn)生超廣譜β-

30、內(nèi)酰胺酶(Extend-spectrum β-Lactamases,ESBLs)持續(xù)產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶,腸球菌,可引起多種臨床感染對(duì)頭孢菌素、林可霉素、磺胺類(lèi)呈現(xiàn)天然耐藥,對(duì)氨基糖甙類(lèi)部分天然耐藥現(xiàn)已出現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE),耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE),由VanA,VanB和VanC控制VanA對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧高度耐藥VanB對(duì)萬(wàn)古霉素高度耐藥,對(duì)替考拉寧敏感VanC對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧高度耐藥選用氯霉素紅霉

31、素四環(huán)素及利福平或其它藥物,葡萄球菌,對(duì)甲氧西林耐藥的葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素中度敏感的葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的葡萄球菌,,對(duì)甲氧西林耐藥的葡萄球菌,由mecA基因編碼的PBP2a與現(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素親和力極低常伴有大內(nèi)環(huán)酯類(lèi)、林可霉素類(lèi)和其它抗生素的多重耐藥常呈異質(zhì)性表達(dá)萬(wàn)古霉素是唯一有確切療效的藥物凝固酶陽(yáng)性和陰性的葡萄球菌均有較高的發(fā)生率,,MRSA的調(diào)控機(jī)制,調(diào)控基因 mec I, mec RIMec I 為阻遏

32、基因，其編碼產(chǎn)物為mec I蛋白，為mec A基因的抑制子（repressor)Mec RI 為誘導(dǎo)劑激活基因，在誘導(dǎo)劑存在時(shí)編碼mec RI蛋白，是一種輔助誘導(dǎo)因子（co-inducer),解除對(duì)mec I蛋白對(duì)mec A基因的抑制,,對(duì)萬(wàn)古霉素中度敏感的葡萄球菌（VISA or GISA),對(duì)萬(wàn)古霉素的MIC在8-16ug/ml已有數(shù)起報(bào)道、主要發(fā)生在MRS中測(cè)定困難：異源性表達(dá)、生長(zhǎng)緩慢、常規(guī)方法不能識(shí)別（K-B法、Mic

33、roScan rapid plate)Vitek 舊版軟件不能測(cè)定（只能測(cè)到4ug/ml萬(wàn)古霉素），新版能測(cè)定,,三、自動(dòng)化技術(shù)在微生物學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用,數(shù)碼及數(shù)值鑒定技術(shù)常見(jiàn)的鑒定系統(tǒng),常見(jiàn)的鑒定系統(tǒng),VITEK AMS系統(tǒng) ＭicroScan系統(tǒng)BD BD Phoenix SystemBBL?Crystal?半自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)BBL?Crystal? AutoReader自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng),,使用自動(dòng)化鑒定儀的局限性,

34、所有實(shí)驗(yàn)室工作人員必須認(rèn)識(shí)儀器的局限性。細(xì)菌的分類(lèi)系統(tǒng)隨著人們對(duì)細(xì)菌本質(zhì)認(rèn)識(shí)的加深而不斷演變，及時(shí)補(bǔ)充和修改數(shù)據(jù)庫(kù)是自動(dòng)化鑒定儀生存的根本要加強(qiáng)對(duì)自動(dòng)化儀器的日常維護(hù)和質(zhì)控 自動(dòng)化鑒定儀得出的結(jié)果，必須要與其它已獲得的生物性狀（如標(biāo)本來(lái)源、菌落特征及其它的生理生化特征）進(jìn)行核對(duì)，以避免錯(cuò)誤的鑒定。,,四、分子生物學(xué)在微生物檢驗(yàn)應(yīng)用,核酸雜交(生物芯片）核酸擴(kuò)增技術(shù) ①靶擴(kuò)增系統(tǒng)，包括PCR、TMA、SDA；②探針擴(kuò)增系統(tǒng)，包

35、括Qbeta復(fù)制酶、LCR；③標(biāo)記擴(kuò)增技術(shù)。④多重PCR，RT-PCR，nest-PCR，RAPD, PCR-SSCP等技術(shù),,-細(xì)菌鑒定及分類(lèi),分子生物學(xué)-耐藥性檢測(cè),耐藥基因的檢測(cè)糖肽類(lèi)：vanA，vanB，vanB2,vanC1，vanC3，vanD。β-內(nèi)酰胺類(lèi)：mecA，blaTEM，blaROB-1，blaSHV，blaIMP，blaMIR-1，blaOXA，blaPER-1，blaPER-2，blaOXY-1，bl

36、aOXA-10/11喹諾酮類(lèi)：gyrA，gyrB，parE  乙胺丁醇：embB，吡嗪酰胺pncA。利福平rpoB。鏈霉素：rpsL，rrs。異煙肼：katG，inhA，ahpC,,應(yīng)用基因技術(shù)進(jìn)行分型和鑒定,菌種鑒定菌株分型研究其親緣關(guān)系：復(fù)發(fā)和再感染判斷分析不同種屬間的差別揭示種內(nèi)不同菌株間的細(xì)微差異彌補(bǔ)了表型分型的不足多用于分子流行病學(xué)研究,這些技術(shù)包括：RAPDRFLPAFLPSSCPPF

37、GEDNA Sequence,細(xì)菌種屬的鑒定,DNA堿基組成的測(cè)定,DNA-DNA雜交,16S rRNA同源性分析,細(xì)菌種屬特異基因,細(xì)菌毒力基因,,,DNA堿基組成的測(cè)定,細(xì)菌間DNA分子同源程度可以用細(xì)菌DNA分子的G+C或A+T摩爾百分比來(lái)反映。親源關(guān)系越近的細(xì)菌，G+C mol%越相近G+C mol%含量不同的細(xì)菌，為不同種細(xì)菌含量相同的可能為不同種的細(xì)菌不同菌屬間G+C mol%范圍在25%-75%之間。細(xì)菌的G+C

38、mol%相當(dāng)穩(wěn)定，不受培養(yǎng)條件、菌齡和其他外界因素影響。最常用的方法是熱變性法，其次是高效液相色譜法和浮力密度法,DNA-DNA雜交,DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補(bǔ)程度，從而推斷不同細(xì)菌基因組間的同源性。目前最常用的是復(fù)性速率法同一菌的復(fù)性率為100%80%-90%的同源為同一種內(nèi)同一亞種的細(xì)菌60%-70%同源性為同一種內(nèi)不同亞種的細(xì)菌20%-60%同源則是同一屬中的不同菌種這種方法還可對(duì)新菌種或表型性狀差別

39、很小而難以肯定的菌株做出較可靠的判定，并可修正其他方法的分類(lèi)和鑒定錯(cuò)誤,16S rRNA同源性分析,rRNA-DNA雜交變性rRNA與變性DNA混合時(shí)，rRNA與其互補(bǔ)的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時(shí)，也能在其同源區(qū)形成互補(bǔ)雙鏈，這種雜交雙鏈的穩(wěn)定性與其同源性成正相關(guān)，適于細(xì)菌屬及屬上水平的分類(lèi)研究。現(xiàn)最常用的是硝酸纖維膜結(jié)合法16S rRNA序列測(cè)定rRNA分子具有高度保守性，在所有的細(xì)胞生物中都存在，在長(zhǎng)

40、期的進(jìn)化中，16SrRNA的總堿基數(shù)有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對(duì)齊進(jìn)行比較,16S-23S rRNA序列測(cè)定,在16S和23S rRNA的間隔區(qū)，各菌種的長(zhǎng)度是不一樣的，利用包含16S和23S rRNA部分序列的引物對(duì)間隔區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，分析其長(zhǎng)度多態(tài)，或結(jié)合RFLP技術(shù)進(jìn)行分析來(lái)鑒定菌種此外限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）、隨機(jī)引物擴(kuò)增法（RAPD）等技術(shù)常用于菌株間的差異比較,細(xì)菌種屬

41、特異基因,某些基因?yàn)榧?xì)菌種特有或?qū)俟灿?，通過(guò)對(duì)這些基因的檢測(cè)可以鑒定細(xì)菌的種或?qū)偃缇幋a吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一組只存在于致病性沙門(mén)菌中的獨(dú)特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于傷寒沙門(mén)菌IS6110、IS986插入片段為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群所擁有等,細(xì)菌毒力基因,某些以毒素致病的細(xì)菌含有特定的毒力基因霍亂弧菌的霍亂毒素基因產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的耐熱（ST

42、）和不耐熱腸毒素（LT）白喉棒狀桿菌的外毒素基因可以應(yīng)用以上技術(shù)測(cè)定毒力基因的存在，以示相應(yīng)的細(xì)菌存在,五、病毒變異的臨床意義,病毒突變體的起源,某些病毒的基因突變率可高達(dá)10-3～10-4（例如逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV），而有些病毒突變率僅為10-8～10-11（如皰疹病毒），相當(dāng)于細(xì)胞DNA的自發(fā)突變率。大多數(shù)RNA病毒的突變率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA病毒誘發(fā)突變 突變具有雙重作用，病毒突變可使其抗原性發(fā)生改變,從而逃逸免疫應(yīng)答，但大

43、多數(shù)突變是有害的，并會(huì)產(chǎn)生許多缺陷顆粒人工突變 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以對(duì)病毒基因組進(jìn)行突變，如直接誘發(fā)寡核苷酸突變和基于PCR的基因突變技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在結(jié)合酶消化技術(shù)（引起基因缺失）和接頭掃描技術(shù)（形成基因插入），可以在病毒基因組的任何特異性位點(diǎn)，準(zhǔn)確安全地誘導(dǎo)出幾乎任何類(lèi)型的突變。這類(lèi)突變可成為人工突變。,病毒突變的類(lèi)型,生化標(biāo)志物基因突變：耐藥基因突變，導(dǎo)致病毒毒力改變的特異突變；形成多態(tài)性，使蛋白質(zhì)和核酸電泳

44、遷移率發(fā)生改變以及對(duì)滅活劑的敏感性改變。缺失突變：在某些方面與無(wú)義突變相似，但可以是一個(gè)或多個(gè)病毒基因缺失，也可以是基因組中非編碼調(diào)控區(qū)（如啟動(dòng)子等）的缺失。自發(fā)缺失突變體通?？稍诓《救后w中累積，生成大量缺陷-干擾（D.I.）顆粒。盡管這些顆粒不具有感染性，但仍有一定的遺傳學(xué)上的意義，有人認(rèn)為它們?cè)谀承┎《靖腥具^(guò)程中以及發(fā)病機(jī)理方面起著重要作用。通過(guò)重組，可以使基因缺失病毒回復(fù)突變?yōu)橐吧筒《?，但發(fā)生頻率通常比較低。,肝炎病毒的變異

45、及基因分型概述,HAV為小RNA病毒科成員，現(xiàn)已被歸入嗜肝RNA病毒科。人源HAV存在4個(gè)基因型（Ⅰ—Ⅳ型），型間核苷酸同源性85%.不同基因型的HAV抗原性相同，因此，HAV只有一個(gè)血清型HBV為嗜肝DNA病毒科成員，可分為6個(gè)基因型（基因型A—F）,不同地域、人種的HBV基因型可能有著不同的分布。基因型的差異與致病性、抗病毒治療效果、預(yù)后等的關(guān)系尚無(wú)明確結(jié)論，尚待進(jìn)一步研究,肝炎病毒的變異及基因分型概述,HDV是一種RNA缺陷病

46、毒現(xiàn)被歸類(lèi)于衛(wèi)星病毒科成員。世界各地HDV不同分離株的核苷酸變異在11%～17%之間。HDV可分為3個(gè)基因型 ，大部分分離株為Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型分別在日本和南美多見(jiàn)。 HCV為黃病毒科成員，該病毒變異較大，目前至少存在6個(gè)以上的基因型。HCV的基因型與致病、預(yù)后、干擾素的治療等密切相關(guān)，需引起高度重視。 HEV為環(huán)狀病毒科成員，感染后導(dǎo)致急性肝炎，臨床表現(xiàn)和發(fā)病經(jīng)過(guò)與甲型肝炎有一定差異，比如妊娠婦女感染的死亡率較高；發(fā)病者年齡分

47、布不明顯；更容易發(fā)生瘀膽；重型肝炎的發(fā)生率高于甲肝；患病后無(wú)終身免疫等等。世界各地的HEV分離株可分為2個(gè)基因型，即緬甸型和墨西哥型，我國(guó)、東南亞各國(guó)及印度流行的為緬甸型。,HBV--生物學(xué)特性,不完全閉合環(huán)狀雙鏈DNAS、C、P和X 4個(gè)ORFsS基因C基因P基因X基因,S基因區(qū)變異,S基因區(qū)包括前S1、前S2及S基因，分別編碼前S1蛋白、前S2蛋白及主蛋白前S1蛋白能調(diào)節(jié)HBsAg的分泌；它的第21～47aa是HBV與靶

48、細(xì)胞上特異受體結(jié)合的主要部位，但第3～77aa均參與HBV感染靶細(xì)胞的過(guò)程前S2蛋白N末端的5個(gè)aa是自被感染細(xì)胞內(nèi)分泌完整病毒顆粒所必需的。前S1起始碼下游第230堿基，可突變形成終止碼，并影響前S2起始碼，這種突變與HBV逃避干擾素治療和宿主免疫清除有關(guān)HBV DNA第2995-3177nt位于前S開(kāi)放讀碼框(ORF)內(nèi)，但其缺失可削弱前S的免疫性，但仍能保留與肝細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，有利于HBV逃避機(jī)體的免疫攻擊，形成慢性攜帶狀態(tài)。

49、,S基因區(qū)變異,HBsAg第99-169aa是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的決定簇。124-137aa和138-l47aa，特別是第142，l44，145aa三處突變，包括典型的“疫苗逃避株”145甘氨酸→精氨酸。這些突變可削弱或改變HBsAg的免疫原性，降低HBsAg被HBIG識(shí)別的能力；這些突變可能是長(zhǎng)期免疫壓力篩選的結(jié)果。,P基因區(qū)變異,P基因區(qū)編碼HBV DNA聚合酶(DNAP)，其自然突變率與逆轉(zhuǎn)錄病毒gag基因相近，每年約為2

50、15;10-4堿基／位點(diǎn)抗HBV藥物胞苷類(lèi)似物拉咪呋啶(1amivudine)和鳥(niǎo)苷類(lèi)似物泛昔洛韋(famciclovir) ，主要作用于DNAP，通過(guò)與底物dNTP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合以抑制HBV的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制HBV耐藥株的突變就發(fā)生在DNAP基因內(nèi)。DNAP催化中心由“酪氨酰(Y)、蛋氨酰(M)、天冬氨酰(D)”基序(YMDD motif)組成，是DNAP發(fā)揮催化活性所必需的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。針對(duì)核苷類(lèi)藥物的抗病毒治療，病毒YMDD中M突變?yōu)楫?/p>

51、亮氨酸(I)或纈氨酸(V)。發(fā)生突變以后可能使病情加劇（即所謂反跳），對(duì)所用藥物產(chǎn)生耐受,S基因區(qū)和P基因區(qū)變異的相互影響,由于S基因區(qū)完全重疊于P基因區(qū)內(nèi)，特別是HBsAg決定簇區(qū)和DNAP致第454-524aa(系主要催化活性區(qū))相重疊，因此，與拉咪夫丁等抗病毒藥相關(guān)的DNAP的突變至少可致HBsAg中5處aa改變DNAP的突變正好位于HBsAg決定簇區(qū)(主要親水區(qū))，提示該處P基因的突變也可導(dǎo)致“中和逃避(neutralizat

52、ion escape)”,C基因區(qū)的調(diào)控序列：,C基因區(qū)中前C和C基因上游的調(diào)控序列基本C區(qū)啟動(dòng)子(basal core promoter，BCP) 可啟動(dòng)前C mRNA和C mRNA的轉(zhuǎn)錄核心上游調(diào)節(jié)序列(core upstream regulatory sequcnce，CURS) 能定向調(diào)節(jié)BCP的活性負(fù)調(diào)節(jié)元件(negative regulatory element,NRE)，可抑制或消除CURS的活性,C基因區(qū)調(diào)控序列

53、的變異,C基因區(qū)調(diào)控序列均可發(fā)生變異，其中最重要和最常見(jiàn)的突變是BCP中的1762nt A→T，l764nt G→A，兩者常同時(shí)出現(xiàn)，與活動(dòng)性肝炎、肝硬變、肝癌、急性肝衰竭等相關(guān)，在后者又常合并l653nt C→T。體外試驗(yàn)顯示這三處聯(lián)合突變可明顯減少前C mRNA及HBeAg的產(chǎn)生。T1762 A1764變異很少在急性肝炎中檢出，主要出現(xiàn)于慢性感染過(guò)程中，可能是宿主免疫篩選的結(jié)果。T1762突變亦多出現(xiàn)于HBeAg／抗HBe

54、血清學(xué)轉(zhuǎn)換時(shí)，可作為判斷HBeAg(+)免疫耐受者發(fā)生免疫激活的指標(biāo)，以及干擾素治療時(shí)選擇合適病例的一個(gè)依據(jù)。,前C基因突變：,前C基因亦可發(fā)生多處位點(diǎn)突變，最有臨床意義的突變是l896nt G→A，可使前C區(qū)第28密碼子TGG(色氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止碼TAG，導(dǎo)致前C蛋白翻譯中斷，HBeAg不能產(chǎn)生；前C起始碼亦可發(fā)生突變而不能啟動(dòng)HBeAg合成，此突變有助于HBV逃避免疫攻擊而形成慢性感染狀態(tài)，也見(jiàn)于干擾素治療后，提示以HBeAg轉(zhuǎn)陰

55、作為疾病好轉(zhuǎn)的指標(biāo)有時(shí)并不準(zhǔn)確。病毒復(fù)制受到干擾后，有可能提高HBV DNA整合入宿主染色體的能力，從而致癌。前C突變先于抗HBe( + )出現(xiàn)者，可能是干擾素等藥物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)換，反之則可能是回復(fù)突變，因?yàn)樵诳笻Be→HBeAg逆轉(zhuǎn)換者的血清中只測(cè)及HBV野生株。,C基因突變：,C基因可發(fā)生多位點(diǎn)多種類(lèi)型的突變，是HBV感染慢性化、肝細(xì)胞損傷加重的重要原因。有3個(gè)突變集中區(qū)域：第48-60aa；第84-10laa，其中第87-97a

56、a更是一變異熱點(diǎn)；第l47-155aa，此處系前體蛋白處理位點(diǎn)，相應(yīng)的DNA序列發(fā)生錯(cuò)義突變或出現(xiàn)終止碼將減少病毒蛋白的產(chǎn)生和分泌。Cariani報(bào)道前C基因變異可同時(shí)合并前S或S基因變異，不能同時(shí)合成HBcAg、前S蛋白等免疫原性蛋白，使HBV更易逃避免疫清除。C區(qū)內(nèi)部缺失突變(core internal deletion，CID)的HBV自然變異株，可見(jiàn)于所有無(wú)癥狀攜帶者、l4％～100％的慢性乙型肝炎患者(香港地區(qū)檢出率僅7％

57、)，以及肝細(xì)胞肝癌、腎移植后使用免疫抑制劑者，但很少在急性肝炎患者中檢出,（五）X基因區(qū)變異,HBxAg也可能成為致敏CTL攻擊的靶抗原?；颊哐逯锌扇苄訦BxAg相關(guān)多肽可調(diào)節(jié)CTL對(duì)靶細(xì)胞的免疫識(shí)別，因此ORF-X變異可能亦不利于清除HBVHBxAg是一種強(qiáng)力反式激活因子，可通過(guò)多種途徑促發(fā)肝細(xì)胞癌變,丙型肝炎病毒變異的意義,HCV RNA 的突變率是真核和原核DNA 復(fù)制突變率的106倍，達(dá)10-3～10-4nt/堿基位點(diǎn).年。

58、以點(diǎn)突變?yōu)橹?，偶可出現(xiàn)插入突變及缺失突變，但核苷酸插入或缺失為3的倍數(shù)。在進(jìn)化過(guò)程中，5’NCR和C最保守，NS其次，E最易變異，尤以E2／NSl基因NH2-末端的高變區(qū)(HVRl)為甚。HVRl變異有下述生物學(xué)意義。免疫逃逸慢性化,基因分型,Simmonds等根據(jù)病毒基因組核苷酸序列的同源性提出了一個(gè)HCV基因型分類(lèi)命名系統(tǒng)該系統(tǒng)將HCV分為6個(gè)主要基因型。每型又由若干亞型組成，不同基因型之間全基因組序列差異達(dá)30％以上

59、或氨基酸差異達(dá)25％～30％，同一基因型中不同亞型之間全基因組序列差異達(dá)20％以上現(xiàn)在有全基因組序列資料的僅1a、1b、2a、2b和3b等5型，亞基因區(qū)序列比較也可取得可信的相同結(jié)果，且更簡(jiǎn)便。目前已知的各基因型E1、NS4、NS5基因序列資料可用于鑒定HCV新的基因型、亞型和無(wú)流行病學(xué)意義的分離株。迄今已發(fā)現(xiàn)HCV的主要基因型有11個(gè)，亞型70余個(gè)。,HCV基因型的地理分布特點(diǎn),HCV基因型分布存在明顯的地理差異其中1a型在美國(guó)

60、、巴西和歐洲西北部占優(yōu)勢(shì)，1b型在遠(yuǎn)東、歐洲東西部多見(jiàn)，2a和2b型多分布于亞洲和歐洲，3a型在西方一些國(guó)家以及泰國(guó)、新加坡多見(jiàn)，并在東印度和孟加拉國(guó)的一些感染人群中的唯一基因型。其他少見(jiàn)基因型的分布則局限于某些持殊區(qū)域，如4型在中東和中非占優(yōu)勢(shì)；5a型局限于南非；6a型主要見(jiàn)于香港、麥加和越南。,HCV基因型的地理分布特點(diǎn),中國(guó)大陸僅有1b和2a兩型，且以1b型為主，在南方城市(南京、南寧、成都)，1b型占90％以上，北方城市

61、(哈爾濱、沈陽(yáng)、蘭州)，2a型占46％～70％。大陸的HCV基因型多樣性不如香港、臺(tái)灣及日本，但混合感染率明顯高于其他國(guó)家和地區(qū)。郭林生等采用Enomoto分型法在10余省、市的122例血清標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因型(RT、K1、K2a、K2b、K3)，其中K1和K2型占75.4％。目前我國(guó)在HCV基因分型中所用方法難以檢出6a或其他新基因型，因此不能除外有其他基因型感染的可能。    迄今尚難對(duì)H

62、CV基因型的地理分布作出解釋。,研究HCV基因型的意義,作為IFN藥效的預(yù)測(cè)指標(biāo)IFN是目前首選的抗HCV藥，但反應(yīng)率僅25％左右。,基因型是IFN藥效的最重要預(yù)測(cè)指標(biāo),K1／1b型和K2a／2a型的長(zhǎng)期緩解率分別為40％和91％。1b型的效果低于1a、2a、2b和3型者，4、5、6型HCV對(duì)IFN治療的反應(yīng)性尚不清楚。在IFN治療前應(yīng)檢測(cè)病人的HCV基因型和血清病毒量，并以此作為療效預(yù)測(cè)指標(biāo)。IFN治療2周后肝組織中負(fù)鏈HCV

63、 RNA陰性也是預(yù)測(cè)IFN長(zhǎng)期療效的有用指標(biāo)。1b型對(duì)IFN治療的低反應(yīng)性原因尚不完全清楚，可能與1b型HCV的E2／NS1糖蛋白高變區(qū)異質(zhì)性程度及病毒復(fù)制能力較強(qiáng)有關(guān)。,研究HCV基因型的意義,與肝損害程度的關(guān)系：文獻(xiàn)報(bào)道1b型HCV與重度慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)關(guān)系密切。1b型者肝組織學(xué)分級(jí)、分期的惡化進(jìn)展速度及血清平均HCV RNA效價(jià)均明顯高于2型；1b型較其他型引起更嚴(yán)重的肝損害；肝細(xì)胞癌患者中1b型陽(yáng)性率

64、明顯高于慢性肝炎和肝硬化者。,研究HCV基因型的意義,1b型HCV致病性較強(qiáng)的可能機(jī)制是：① E基因區(qū)另有一高變區(qū)，隨時(shí)間推移其突變率增加3～4培，使病毒有可能逃避宿主的免疫監(jiān)視；② 表達(dá)或編碼的蛋白有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。多因素分析顯示1b型是肝癌發(fā)生最重要的危險(xiǎn)因子也有不支持上述觀點(diǎn)，需進(jìn)一步研究包括建立體內(nèi)、體外HCV復(fù)制和蛋白表達(dá)模型等,研究HCV基因型的意義,HCV感染的診斷：HCV各基因型的基因組核苷酸序列差異導(dǎo)致其表達(dá)的蛋

65、白免疫原性和抗原性的區(qū)別，抗原性變異，尤以非結(jié)構(gòu)編碼區(qū)蛋白如C33(NS3)、C-100(NS4)、NS5(NS5a)較大目前所使用的第3代抗體幾乎都來(lái)自1a型HCV的重組蛋白抗原，感染1a型的獻(xiàn)血者抗體血清效價(jià)是感染2、3型者的4.5倍，在非1型感染為主的國(guó)家應(yīng)用此抗體檢測(cè)時(shí)應(yīng)慎重解釋檢測(cè)結(jié)果。目前有學(xué)者采用不同基因型HCV的重組蛋白建立HCV抗體檢測(cè)方法，應(yīng)根據(jù)本地HCV基因型特點(diǎn)研制診斷試劑,研究HCV基因型的意義,HCV疫苗

66、的制備：有效的疫苗是防治HCV感染的重要手段。有效的HCV疫苗應(yīng)包含各主要基因型的免疫原，研制HCV疫苗還有許多問(wèn)題需要解決，最重要的是要明確是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體為主，還是以激發(fā)細(xì)胞毒T細(xì)胞活性為主，目前認(rèn)為以C和NS3蛋白或多肽(與高度保守的T細(xì)胞位相一致)為基礎(chǔ)的疫苗比E蛋白更能誘導(dǎo)廣泛的交叉保護(hù)反應(yīng)。其他：HCV基因型研究對(duì)鑒定傳染源和追蹤傳播途徑也有重要意義,復(fù)習(xí)題,目前臨床常見(jiàn)的耐藥問(wèn)題有哪些？用分子生物學(xué)的手段怎樣鑒