細胞工程—動物細胞培養(yǎng)細節(jié)復習題

1、動物細胞原代培養(yǎng)技術(shù)細節(jié)1、原代培養(yǎng)：、原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖分裂繁殖、細胞的接觸抑制接觸抑制、以及細胞的衰老衰老，死亡死亡等生命現(xiàn)象。2、傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。3、無菌操作基本技術(shù)、無菌操作基本技術(shù):3.1實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外紫外燈照射30

2、60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風扇風扇運轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實驗操作。3.2每次操作只處理一株細胞株一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆誤混淆或細胞間污染細胞間污染。3.3實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。3.4無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸

3、管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。3.5實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應在臺面中央無菌區(qū)域，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。3.6小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。3.7工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進

4、行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少ClassII)。操作過程中，應避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。3.8定期檢測下列項目：①CO2鋼瓶的CO2壓力②CO2培養(yǎng)箱的CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。③無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(wǎng)(300小時預濾網(wǎng)，

5、3000小時HEPA)。4、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基4.1液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。4.2液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個月，期間谷氨酰胺可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量谷氨酰胺。4.3粉末培養(yǎng)基配制(注意)：細胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清、pH為7.27.4。粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應分別溶解后分別溶解后才混合，然后用CO2氣體氣體調(diào)整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離

6、子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。純水配制。以0.1或0.2mm無菌過濾膜過濾滅菌。標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。須作生長試驗與污染測試。5、抗生素、抗生素5.1.細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素5.1.1.培養(yǎng)自ATCC引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。5.1.2.培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，須添加抗生素，待tokenfreeze通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。4可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清

7、種類？可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。5何謂何謂FBSFCSCSHSFBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS(calfse

8、rum)則是指小牛血清。HS(hseserum)則是指馬血清。6培養(yǎng)細胞時應使用培養(yǎng)細胞時應使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？？或根本沒有影響？一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3CO32H作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養(yǎng)時應使用10%CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5%CO2培養(yǎng)細胞。7何時須更換培養(yǎng)基？何

9、時須更換培養(yǎng)基？視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。8培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。9附著性細胞繼代時所使用之附著性細胞繼代時所使用之trypsinEDTA濃度？應如何處理？濃度？應如何處理？一般使用之trypsinEDTA濃度為0.05%trypsin0.53mMEDTA。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試

10、管中，保存于–20C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。10懸浮性細胞應如何繼代處理？懸浮性細胞應如何繼代處理？一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。11欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速？欲將一般動物細胞離心下來

11、，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速？欲回收動物細胞，其離心速率一般為300xg(約1000rpm)，510分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡。12細胞之接種密度為何？細胞之接種密度為何？依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。13細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含510%DMSO(dimethylsulfoxide)和

12、9095%原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。14DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？之等級和無菌過濾之方式為何？冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4C，避免反復冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物