轉化紫花苜蓿的研究

1、轉化紫花苜蓿的研究摘要：在已建立的紫花苜蓿Medicagosativa體細胞胚高頻再生體系的基礎上，研究了侵染時間、負壓處理、預培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間、脫菌及選擇方法等因子對轉化效率的影響，并初步獲得了抗性體肚。關鍵詞：紫花苜蓿；體細胞胚；根癌農桿菌；AziVHXl遺傳轉化土壤鹽堿化是人類面臨的世界性難題。據不完全統(tǒng)計，全球約有9.5X10shmz鹽堿地，分布于100多個國家，其中中國的鹽漬地面積約為9.9X107hm2并有逐年擴大的趨勢通過

2、生物技術培育耐鹽作物品種是改良利用大面積鹽荒地、緩解我國現(xiàn)有人口對土地壓力的有效措施之—。紫花巷猜Medicagusativa素有“牧草之王”的美稱，具有豐富的營養(yǎng)價值和廣泛的生態(tài)適應性[3]。研究表明，在鹽堿地上種植紫花苜蓿可以顯著改善鹽潰土的理化性質，降低土壤含鹽量[1]。但由于紫花苜蓿數千年來生長在低鹽或非鹽漬化土壤中，其抗鹽能力較弱，屬于中等抗鹽作物，所以較難在鹽堿地上種植。Na是造成植物鹽害的主要離子之一。植物細胞抵御其內部鹽

3、脅迫的主要方式是將細胞內過多的Na泵人液泡，這一過程是由液泡膜NaH逆向轉運蛋白（AtNHXl)完成的。將抗鹽基因AfNHXl轉人其它作物如番前Lycopersiconesculentum[5]、油菜Brassicanapus[6]、小麥Tritivumaestivum[7]和玉米Zeama0yS[8]等已有許多成功報道，而且抗鹽基因UNHX1的表達確實能夠明顯提高上.Advancesinstudiesongeictransfmatio

4、noftallfescueWUGuantingCHENJinqing(InstituteofVirologyBiotechnology?ZhejiangAcademyofAgriculturalSciencesHangzhou310021China)Abstract：Tallfescue(Festucaarundinacea)isanimptantperennialcool~seasongrassspecieswidelyplanted

5、ffageturfpurposesintemperateregionsthroughoutthewld.Falongtime，tallfescuehasbeenimprovedbytraditionalbreeding.Advancesintransgenictechnologyhaveprovidedaneffectivewayfdevelopmentofnewcultivarsoftallfescue.Atpresentstudie

6、stoimprovetolerancestoadverseenvironments，resistancestodiseasespestsherbicidesaswellasqualitytraitsofthisgrassspeciesbygeicengineeringarebeingcarriedoutinalotofcompanieslabatiesathomeabroad.Inthispaper，progressesingeictr

7、ansfmationoftallfescuewerereviewedintermsofrecipientmaterialstransfmationmethods，targetgenesinfluencingfactstransgeneinheritance.Keywds：Tallfescuegeicengineering；recipientmaterial；transfmationmethod；transgene；inheritance

8、下胚軸出愈率隴東下胚軸出愈率大葉體胚分化率隴東—o體胚分化率大葉oooo050100Kan濃度(mg10圖3卡那霉素（Kan)對紫花苢蓿下胚軸和體莊的影響8642%)鱭傘^培養(yǎng)3周；而液體脫菌是將共培養(yǎng)后的外植體先轉人加有200mgLCarb的MSH液體培養(yǎng)基中180rpm振蕩洗滌3d，然后用無菌濾紙吸干外植體上的液滴，再轉移到固體脫菌培養(yǎng)基MSH200mgLCarb上24C暗培養(yǎng)2周，然后24C，16hd光照培養(yǎng)1周。在對抗性體胚進行

9、選擇時，同時采取了前期選擇和延緩選擇2種方法。前期選擇就是共培養(yǎng)后，在脫菌培養(yǎng)基MSH200mgLCarb中同時加人50mgLKan延緩選擇是指共培養(yǎng)后，先在MSH200mgLCarb培養(yǎng)基上進行脫菌培養(yǎng)3周，之后將脫菌的胚性愈傷轉人SHMmgLKan100mgLCarb上暗培養(yǎng)10d，再光照培養(yǎng)10d。在后續(xù)繼代中去掉Carb，直到有成熟體胚形成（有不定芽產生）。2結果與分析2.1抗生素抑菌濃度的確定Carb是植物基因工程中經常使用的

10、一種脫菌抗生素。LBA4404是紫花苜蓿遺傳轉化中使用最多的一種根癌農桿菌Carb的抑菌實驗結果表明(圖2)，該農桿菌菌株LBA4404對Carb特別敏感，在Carb濃度為100、200和500mgL，ODwl值分別為0.019、0.016和0.015，且在Carb濃度為200500mgL時，()D6。。值基本沒有變化。由此可見，200mgL的Carb便可完全抑制農桿菌LBA4404的生長，這與Shao等D1]發(fā)現(xiàn)的LBA4404對Ca

11、rb較為敏感的結果相一致。所以，在本實驗中選用200mgL的Carb作為LBA4404的脫菌濃度。0.2■0.00100200300400500Carb濃度（mgL)圖2羧芐青霉素(Carb)對農桿菌LBA4404生長的影響2.2選擇培養(yǎng)基中Kan選擇壓的確定不同的植物材料對Kan的敏感性或抗性會有所不從圖3可以看出，當Kan濃度為50mgL時，隴東苜蓿下胚軸出愈率為5%，大葉苜蓿下胚軸出愈率為7%。而當Kan濃度為80mg丨：時，仍不

12、能將其有效殺死。只有Kan濃度增加到100mgL時，隴東和大葉苜蓿下胚軸出愈率才都降為0。由此可知，Kan對紫花苜蓿下胚軸的最佳選擇壓為100mgL。從圖3還可以看出，與下胚軸相比，當Kan濃度為40mgL時，隴東和大葉苜蓿體胚分化率均已降至2%當Kan濃度在50mgL以上時，隴東和大葉苜蓿體胚均不能分化出不定芽，隨著培養(yǎng)時間的延長，大部分體胚停止發(fā)育并褐化死亡。所以，對紫花苜蓿體胚而言，Kan最佳濃度選擇為50mgL。2.3對轉化效率

13、的影響在研究中發(fā)現(xiàn)，當OD_低于0.5時，被侵染的下胚軸和體胚沒有出現(xiàn)褐化腐爛的現(xiàn)象，但也沒有得到抗性愈傷或體胚。而當（)D_大于0.7時，在篩選培養(yǎng)基上，下胚軸和體胚均出現(xiàn)了大量褐化和腐爛的現(xiàn)象。在（)0_為0.5?0.7時，侵染的下胚軸和體胚基本上沒有出現(xiàn)腐爛的現(xiàn)象，在篩選培養(yǎng)基同。所以，在實驗過程中，根據植物材料的不同，篩選出一個能將未轉化細胞殺死，而又能使轉化細胞存活下來的Kan臨界濃度至關重要。研究也發(fā)現(xiàn)，不同的紫花苜蓿品種和